[发明专利]处理腺相关病毒的方法及试剂盒

说明书

本发明提出了处理腺相关病毒的方法及试剂盒。所述方法包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白‑结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。由此，利用本发明处理腺相关病毒的方法可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，并且具有操作简便、准确性高、可重复性好、成本低等优点，适于规模化应用。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及处理腺相关病毒的方法及试剂盒。

背景技术

病毒载体在基因转移和基因治疗中有广泛的应用。其中腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因具有无致病性、理化性质稳定、免疫原性弱、可定点整合到真核细胞染色体中从而介导外源基因的长期稳定表达等特点而越来越受到关注，在基因转移和基因治疗领域具有广阔的应用前景。

然而，目前腺相关病毒的纯化、鉴定及滴度测定方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

超速离心法是最为广泛使用的一种分离AAV的方法，根据杂质与AAV载体的形状、大小以及等密度点的不同，在高速离心作用下实现分离。但不足之处在于操作时间较长，完成2～3次超速离心，需要48～72h，AAV载体长期在黏性或者高渗透压(蔗糖或者CsCl)的溶液中及超速离心的强剪切力作用下，可能会导致载体粒子活力降低；要求操作人员的技术水平要高，若操作不当，则损失严重；在AAV的大规模纯化时，通常需要处理10～200L的细胞裂解液，反复的离心处理，操作烦琐，不利于载体的大规模纯化。

色谱柱层析法也是AAV规模化纯化的一种重要方法。当澄清的病毒液流经固定相时，固定相的功能区域与AAV衣壳蛋白或者所含有的基因组相互作用，通过改变流动相的组成或者pH值而实现分离。最常用的方法是肝素亲和层析分离纯化方法，该方法为AAV2最为普遍使用的纯化方法。但是该方法很难用于其他血清型载体。当溶液的pH大于AAV的等电点时，也可以采用阴离子色谱进行分离，如Poros HQ、Poros PI、Source 15Q、Q-Sepharose、HiTrap Q等用于纯化AAV1、2、4、5、6、8。但不足之处在于不同血清型的病毒载体理化性质有所差异，因此需要根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。由此可见，这两大类常用方法均有着其一定的缺陷，限制了规模化的生产。

rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。斑点杂交法是AAV滴度测定的传统经典方法，但该方法消耗时间长、定量精确性低、过程复杂、成本比较高、测定结果重现性差，差异可达10倍以上。采用PCR技术检测rAAV基因组序列，可以将测定灵敏度提高10倍，定量PCR技术的运用则又可提高10倍以上。相对于斑点杂交法的2天时间，大大增加了效率，且qPCR法精确度高、操作简单、成本低廉。但作为标准检测方法其重现性不甚理想，并且由于细胞裂解液及培养液中未知成分会抑制PCR反应的进行，大量的DNA和RNA严重干扰PCR测定；生产细胞中含有转基因序列的双链DNA含量要高出rAAV内部包装的单链DNA(目的DNA)1个数量级。如何排除以上干扰，是定量PCR技术能否应用于大规模生产过程质控的关键。