[发明专利]源自BDFP近红外光荧光蛋白的新型荧光标记物及其融合蛋白

说明书

本发明公开了一种远红光荧光蛋白，所述远红光荧光蛋白包括BDFP近红外光荧光蛋白，并且包括在第113位氨基酸处的突变，且在第120位氨基酸处不发生突变，其中，所述BDFP近红外光荧光蛋白的氨基酸序列如SED ID NO：2所示。本发明进一步公开了一种包括该远红光荧光蛋白的融合荧光蛋白。本发明还公开了一种编码该远红光荧光蛋白或融合荧光蛋白的核酸，及包括该核酸的载体。

技术领域

本发明属于荧光标记物领域。具体地，本发明涉及一种远红光荧光蛋白及其融合荧光蛋白，编码该远红光荧光蛋白或其融合荧光蛋白的核酸及载体。

背景技术

远红光(FR)或近红外光(NIR)在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，是穿透皮肤等大部分组织的能力最大的光谱区域。具有这类发光色素基团的荧光蛋白更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记物。

目前该类荧光标记物主要有两种，分子量大小均在35kD左右。一种源自绿色荧光蛋白 (GFP)，能自催化形成发色团，但是光谱范围有一定局限性，最大荧光发射波长一般在670nm 左右，例如标记物TagRFP675。另一种源自存在于细菌中的受体蛋白，细菌光敏色素蛋白 (BphP)。BphP主要利用线性四吡咯结构的胆绿素(BV)作为发色团；同时胆绿素BV广泛存在于真核生物体内，这意味着BphP类荧光标记物可应用于活的动物细胞和组织，且无需任何酶或外源辅助因子。BphP类标记物的代表有iFP系列和iRFP系列，荧光发射波长范围为670nm～720nm，比如IFP2.0最大荧光发射波长714nm。

但是现有可激发出远红光或近红外光的荧光蛋白的分子量较大，活体检测时易聚集沉淀，而且不耐受极端环境，适用场合有限。

藻胆蛋白(phycobiliprotein)存在远红光范围的荧光发射，机制与细菌光敏色素蛋白 (BphP)类似，主要源自于非共价结合的藻蓝胆素(PCB)。典型的藻胆蛋白类荧光标记物例如ApcA、smURFP、ApcF2，它们的最大荧光发射波长为698nm。

Ding W L等人基于藻胆蛋白体的核心亚基ApcF2的序列，进行基因改造后得到了几种新的荧光藻胆蛋白并将其命名为BDFP，这些BDFP蛋白可共价结合胆绿素BV，性能比ApcF2 稳定(Ding W L，Miao D，Hou Y N，et al.Small monomeric and highly stablenear-infrared fluorescent markers derived from the thermophilicphycobiliprotein，ApcF2[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular CellResearch，2017，1864(10)：1877-1886)。另外，这些BDFP 蛋白的分子量较小，约15kD，最大荧光发射波长为710nm左右。

虽然Ding W L等人得到的BDFP蛋白很好地弥补了现有的远红光或近红外光的荧光蛋白的上述缺点，但是这些蛋白荧光发射波长比较单一(均在710nm左右)，因此不能有效地组合使用。因此通过基因工程改造，得到亮度更高、光谱性质更为多样和优异的荧光蛋白，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于通过同源序列比对，选择保守功能位点，并确定目标突变位点。

本发明的另一目的在于提供一种发射出远红光的经基因改造的藻胆蛋白及其融合荧光蛋白。

本发明的又一目的在于提供一种编码本发明的经基因改造的藻胆蛋白及其融合荧光蛋白的核酸，和编码该核酸的载体。

在本发明的一个方面中，提供了一种远红光荧光蛋白，所述远红光荧光蛋白可以包括近红外光BDFP蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位氨基酸处的突变，且在第120位氨基酸处不发生突变。所述近红外光BDFP蛋白的氨基酸序列如SED ID NO：2所示。