[发明专利]肺腺癌检测试剂盒及检测CCND1基因甲基化水平的方法

说明书

本发明公开了一种肺腺癌检测试剂盒以及检测CCND1基因甲基化水平的方法。本发明的肺腺癌检测试剂盒包括如SEQ ID NO:1序列所示的CCND1基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的CCND1基因反向引物、如SEQ ID NO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。本发明通过检测癌组织中CCND1基因甲基化水平与癌旁组织CCND1基因甲基化水平的差异，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肺腺癌检测试剂盒及检测 CCND1基因甲基化水平的方法。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC/WHO)报道，2002年全球肺癌男性发病率为35.5/10万，发病97万人，死亡率为31.2/10万，死亡85 万人；女性发病率为12.1/10万，发病39万人，死亡率为10.3/10万，死亡 33万人。我国卫生部2008年4月公布的《第三次全国居民死亡原因调查》显示，在过去的30年中，我国肺癌发病率增量较大，已经取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。根据WHO的病理学分析，肺癌分为四种主要组织类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者还可进一步分为肺腺癌、磷状上皮癌和大细胞癌。

为了对肺癌进行诊断，一般都综合运用多种方法。到目前为止，通过对肺部原发肿瘤以及转移性肿瘤(包括淋巴结及其它组织器官)进行病理活检并通过免疫组化方法进行分析是当前国际公认的诊断疾病的金标准。此外，还可以结合胸部X线摄影、胸部计算机断层扫描、纤维支气管镜等进行辅助诊断。与病理诊断相比，其它辅助诊断方法均有不同的缺陷与不足，如采用胸部计算机断层扫描，肺癌的大小必须达到0.1cm以上才能够进行测定，在这一时期，癌症很可能已经转移到了其它组织。因此，一种早期、有效诊断肺癌的方法十分必要。

DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是表观遗传学的一部分。在哺乳动物中，DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子的胞嘧啶环的5'碳上， DNA甲基化一般发生在占人类基因组约1％～2％的CpG位点上。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。人们发现表观遗传在肿瘤的发生发展过程中也起着重要作用，其中DNA甲基化水平改变是较早也是较为重要的表观遗传改变之一。DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面：一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。DNA甲基化与癌症的发生发展密切相关，因此研究与癌症发生发展相关的DNA甲基化具有重要的临床意义，特定基因启动子区域甲基化的甲基化状态可以作为癌症的临床诊断的辅助性标志来预测癌症的发生发展及预后。

通过189例肺腺癌和149例正常人血液进行甲基化芯片检测，发现在肺腺癌血浆中Cyclin D1编码基因(即细胞周期素D1基因，简称CCND1基因) 的低甲基化状态可能与肺腺癌的发生、发展相关。可以作为肺腺癌早期诊断的一个特异性分子标记。检测CCND1基因的甲基化状态，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。