[发明专利]AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒及其在治疗结直肠癌药物中的用途

说明书

本发明涉及一种AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒及其制备方法，在载体的酶切位点后分别插入U6启动子、靶向人AURKA基因的干扰靶点序列和U6启动子、靶向人UHRF1基因的干扰靶点序列，获得质粒转入表达菌株经培养筛选得到氨苄西林耐受克隆菌株，摇菌后包装得到AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒；用本发明所述AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒感染结肠癌SW480细胞，以Aurora‑A和UHRF1作为协同施药靶标，能够降低肿瘤细胞内Aurora‑A和UHRF1的表达水平，并且十分显著地抑制结肠癌细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒及其在治疗结直肠癌的用途。

背景技术

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。目前结肠癌的治疗效果尚不理想。Aurora-A是参与调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，大量研究显示，Aurora-A在结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤中异常高表达。此外，该区域扩增也被认为与患者预后不良有关。

然而，Aurora-A抑制剂在临床前期实验治疗效果并不理想。泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)是最新发现的一种癌基因。它参与维持DNA甲基化、细胞增殖、周期调控等。抑制UHRF1虽能抑制细胞增殖、促进凋亡，但是体外实验结果表明：单一阻断UHRF1并不能有效的抑制肿瘤细胞的生长。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒及其在治疗结直肠癌的用途。本发明所述AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒以Aurora-A和UHRF1作为协同施药靶标，能够降低肿瘤细胞内Aurora-A和UHRF1的表达水平，并且十分显著地抑制结肠癌细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

本发明所采用的技术方案为：

一种AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒的制备方法，包括如下步骤：

(1)在载体的酶切位点后分别插入U6启动子、靶向人AURKA基因的干扰靶点序列和U6启动子、靶向人UHRF1基因的干扰靶点序列，得到质粒；

(2)将质粒转入表达菌株，培养筛选得到氨苄西林耐受克隆菌株；

(3)对步骤(2)所述氨苄西林耐受克隆菌株进行摇菌，得到AURKA/UHRF1双基因共干扰质粒；

(4)对步骤(3)所述AURKA/UHRF1双基因共干扰质粒进行包装，即得AURKA/UHRF1双基因共干扰慢病毒。

步骤(1)中，所述载体为CV147，所述载体的酶切位点为Pac I和Nhe I。

步骤(2)中，所述表达菌株为大肠杆菌感受态细胞。

步骤(2)中，培养筛选氨苄西林耐受克隆菌株的具体操作如下：

将质粒分散于双蒸水中，配制得到质粒在双蒸水中的浓度为100ng/μl；将细胞数为5×10⁶个感受态表达菌株悬浮于100μl含甘油15％、浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液中，之后取1μl分散有质粒的双蒸水加入到100μl悬浮有感受态表达菌株的CaCl₂溶液中，置于冰上20min；之后在42℃热敷90s，再迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液；37℃、220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50-100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，得到氨苄西林耐受克隆菌株。

步骤(3)中，对所述氨苄西林耐受克隆菌株进行摇菌的具体操作如下：