[发明专利]一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌表达蛋白中的应用

说明书

本发明公开了一种可静态和动态调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的N端序列元件及应用，属于基因工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在目的蛋白编码基因前添加内源性蛋白N端编码前15个氨基酸的核酸序列，并在质粒中游离表达，使得枯草芽孢杆菌目的蛋白的表达实现在不同生长阶段的表达差异调控与表达量的调控。其中调控的类型包括：生长偶联型(等N_Hbs等)、迟滞表达型(N_PdhD等)、持续表达型(N_GlnA等)、强烈抑制型(N_Sat等)。同时，通过调控，使得目的蛋白相对表达量跨越四个数量级，为枯草芽孢杆菌目的蛋白高效表达和基因工程改造奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种可静态和动态调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的N端序列元件及应用，属于基因工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌的代表，其不产生内毒素，是非致病的微生物，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证是安全的(Generally recognizedas safe，GRAS)食品级微生物。作为实验室中最常用的出发菌株，也作为在工业酶制剂生产、高附加产物的合成以及科学研究中广泛应用的菌株，枯草芽孢杆菌具有很多优势，包括：生长速度快，培养时间短，培养要求低；分泌信号肽的系统十分高效，使得其分泌蛋白能力强，这对后续蛋白提取工艺提供了很大便利；其分子伴侣系统十分高效，使得其在表达大部分真核来源的蛋白时，可以使得蛋白仍然保持其原有构象和活性。枯草芽孢杆菌的优势使得其在发酵行业应用十分广泛，其表达系统在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注,并有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达系统。

然而，目前已开发的调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达的标准元件尚不完善。例如，启动子和终止子序列相对较长，增加了遗传操作的难度和DNA序列合成的成本。此外，大多数标准元件侧重于转录水平的调节，翻译水平调控工具和元件较少。同时，目前翻译水平的调控元件仅注重于调控目的基因的表达量，而没有发现其在动态调控中的作用。动态调节具有重要意义，可以最大限度地提高底物的利用效率，从而最大限度地提高代谢工程中高附加值产品的产量。因此，开发翻译水平上易于使用的动态控制工具也很重要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达中的应用，是将具有调控功能的N端编码前15个氨基酸的特定核苷酸序列克隆并添加至目的蛋白的N端，构建到重组表达质粒中，再转化到枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述特定核苷酸序列包括SEQ ID NO.1～97中的任意一种。将这些N端序列元件按调控功能分为四类，包括生长偶联型(SEQ ID NO.1～15，N端序列元件调控目的蛋白主要在稳定期之前表达)、迟滞表达型(SEQ ID NO.16～17，N端序列元件调控目的蛋白主要在对数生长末期及稳定期表达)、持续表达型(SEQ ID NO.17～90，N端序列元件调控目的蛋白的表达贯穿于细胞生长的所有时期)、强烈抑制型(SEQ ID NO.91～97，N端序列元件调控目的蛋白表达被强烈抑制)。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)。

在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体，将具有调控功能的N端序列连接在目的蛋白的N端，表达在枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。