[发明专利]一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法

权利要求书

1.一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)根据绿色荧光蛋白基因的序列信息，设计并合成引物，以pEGFP-C1载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光蛋白的基因序列；

(2)用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro载体，将酶切产物连接，获得pLenti-puro-GFP质粒；

(3)无内毒素提取pLenti-puro-GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切pLenti-puro-GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳检测序列大小，同时将pLenti-puro-GFP质粒送测序检测序列准确性；

(4)用pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收集病毒上清，将病毒上清感染Hep-2细胞，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。

2.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株构建方法，其特征是步骤(1)所述的绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ.ID.NO.1；pLenti-puro载体基因序列如SEQ.ID.NO.2；载体pLenti-puro-GFP的基因部分测序结果序列如SEQ.ID.NO.3。

3.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(1)所述的引物为SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。

4.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(1)中PCR扩增的反应条件为：95℃，3-5min；95℃,30Sec；57℃,30Sec；72℃1min；25-30个循环。

5.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(2)中用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列后回收的产物与和pLenti-puro载体质粒按照5：1的摩尔比用连接酶solution I在4℃过夜连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，获得目的载体pLenti-puro-GFP质粒。

6.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(3)中无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP质粒的具体方法为：

(31)取测序验证正确的pLenti-puro-GFP菌液20微升，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的15mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；

(32)无内毒素质粒小提试剂盒提取培养的菌液中的pLenti-puro-GFP质粒，测定浓度。

7.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(4)中筛选细胞的具体方法为：

(41)将1个60mm细胞培养皿中汇合度90％的293T细胞传代到3个60mm细胞培养皿中，待细胞汇合度达到60-70％时进行转染；

(42)用lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，转染6小时后换成20％血清的培养基，转染48h后，收集pLenti-puro-GFP病毒上清；

(43)将60mm细胞培养皿中汇合度90％的喉癌细胞Hep-2传代到3个60mm细胞培养皿中，待细胞汇合度达到60％时用pLenti-puro-GFP病毒上清感染细胞，感染24h后换成含有嘌呤霉素的细胞培养液，在倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，直至筛选出稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。