[发明专利]枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株，其保藏编号为CCTCC NO：M2018234。

2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株在制备细菌素和纤维素酶中的应用。

3.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株制备细菌素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株接于LA固体培养基上培养，得到单菌落；

2)种子液制备：将挑取的单菌落接种于LB液体培养基中培养，至菌株对数生长中期，得到种子液；

3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中培养发酵，得到发酵液，其中，种子液的接种量为0.5～2％；所述产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L；

4)细菌素粗提：微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为20～40％，沉淀培养液，离心再用PBS溶解沉淀，得到细菌素粗提液；

5)对细菌素粗提液在无菌状态下进行过滤除菌，得到细菌素。

4.根据权利要求3所述制备细菌素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件：培养温度为30～37℃，时间为12～24h，

LA固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L；

所述步骤2)中，培养条件：培养温度为30～37℃、时间为5～24h、摇床转速为150～220r/min；

LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L。

5.根据权利要求3所述制备细菌素的方法，其特征在于：所述步骤3)中，培养条件：培养温度为30～37℃，摇床转速为150～220r/min、时间为12～24h。

6.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：

1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株接于LA固体培养基上培养，得到单菌落；

2)种子液制备：将挑取的单菌落接种于LB液体培养基中培养，至菌株对数生长中期，得到种子液；

3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产纤维素酶培养基中培养发酵，种子液的接种量为0.5～2％；产纤维素酶培养基配方：MgSO₄·7H₂O 0.3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄·3H₂O1.5g，NaCl 1g，酵母粉0.5g，蛋白胨20g，CMC-Na 20g，加水定容至1L；

4)纤维素酶粗提：收集发酵液，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，得到纤维素酶粗提液；

5)对纤维素酶粗提液进行冷冻干燥，即得到纤维素酶。

7.根据权利要求6所述制备纤维素酶的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件：培养温度为30～37℃，时间为12～24h，

LA培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L；

所述步骤2)中，培养条件：培养温度为30～37℃、时间为5～24h、摇床转速为150～220r/min；

LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L。

8.根据权利要求6所述制备纤维素酶的方法，其特征在于：所述步骤3)中，培养温度为30～37℃，摇床转速为150～220r/min、时间为12～24h。