[发明专利]一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及其构建与应用

说明书

本发明提供一种高产L‑苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株。本发明还提供一种上述基因工程菌株的构建方法。该方法利用基因敲除技术破坏黑曲霉草酰乙酸水解酶基因(oahA)从而获得了苹果酸高产菌株S2。经过7天摇瓶发酵，可将100g/L的葡萄糖转化成120.4±2.8g/L L‑苹果酸，苹果酸对葡萄糖的转化率达到1.62mol/mol，达到理论最高转化率的81％。为苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株。

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地说涉及一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株的构建及应用。

背景技术

L-苹果酸，又名2-羟基丁二酸，主要用于食品、医药等行业。在食品行业，由于L-苹果酸味道柔和、酸度大，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L-苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。此外，L-苹果酸在日化保健业等行业也有广泛的应用前景。因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。

当前，化学合成法和固定化酶技术是工业上生产苹果酸的主要方法。其中，化学合成法生产的苹果酸为消旋型DL-苹果酸，而一些国家规定饮料和药品中不能使用DL-苹果酸，限制了消旋型苹果酸的应用范围。固定化酶技术虽然可以光学纯度的L-苹果酸，但是其底物富马酸来源于石油基化学品马来酸。因此，具有较好经济、环境和社会效益的发酵法生产L-苹果酸成为研究的热点。然而，目前发酵法生产苹果酸存在的问题仍是缺乏优良的生产菌株。利用黄曲霉菌株发酵合成L-苹果酸，虽然能够获得113g/L的产量，但是由于产生黄曲霉毒素和高浓度杂酸，限制了其工业应用。近年来应用基因工程策略，对大肠杆菌、酵母菌等微生物代谢途径进行改造获得基因工程菌株取得较大进展，但是由于产量不够高或者有大量副产物杂酸的存在等瓶颈，阻碍了其工业化发酵生产苹果酸的进程。

黑曲霉的优势：黑曲霉作为重要的细胞工厂用于柠檬酸发酵生产已有100多年的历史，具有非常强的耐酸性，在pH低于2的条件下能够正常生长，不仅是GRAS(generallyregarded safe)菌株，而且能够利用廉价的碳源。然而由于野生型黑曲霉菌株较低的苹果酸产量，鲜有研究报道通过代谢工程策略，改造黑曲霉菌种用于苹果酸的发酵生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。

一种高产L-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是过表达黑曲霉来源的丙酮酸羧化酶基因pyc和黑曲霉来源的苹果酸脱氢酶基因mdh、异源表达米曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白C4T318基因并敲除了草酰乙酸水解酶基因oahA的黑曲霉基因工程菌株。

本发明所用的宿主菌株是本实验室构建的能够表达Cre重组酶的黑曲霉菌株S469。所述S469菌株是在基因组内整合了外源cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达。当以所述菌株S469为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，可通过强力霉素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达或敲除且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留。

所述黑曲霉基因工程菌株是过表达黑曲霉来源的丙酮酸羧化酶基因pyc和黑曲霉来源的苹果酸脱氢酶基因mdh、异源表达米曲霉来源的四碳二羧酸转运蛋白C4T318基因并敲除了草酰乙酸水解酶基因oahA的黑曲霉基因工程菌株。

本发明所述基因pyc序列在NCBI-locus_tag是An04g02090，所述基因mdh序列在NCBI-Gene ID是4987622，所述C4T318基因在NCBI-Gene ID是5992883，所述基因oahA序列在NCBI-locus_tag是An10g00820。