[发明专利]一种重组载体CAR-CD244-antiPSMA的制备方法

说明书

本发明涉及一种重组载体CAR‑CD244‑antiPSMA的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将特异性抗体编码基因使用末端带有BfuAI限制性内切酶识别位点的引物进行PCR扩增；所述特异性抗体编码基因序列为PSMA抗体的部分序列，为序列表序列3；步骤2、将步骤1的PCR产物分别进行纯化；步骤3、将步骤2纯化的PCR产物在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切，并同时将含有改造的CD244骨架的克隆载体在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切；步骤4、将酶切后产物进行纯化；步骤5、将纯化后的产物按抗体片段与含有改造的CD244骨架的克隆载体摩尔比为3:1配比后，使用T4连接酶进行连接、转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序；将连接正确的质粒，命名为：重组载体CAR‑CD244‑antiPSMA。

本申请是分案申请，原申请的申请号为201710209997.5，申请日为2017年3月31日，发明名称为“一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用”。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种重组载体CAR-CD244-antiPSMA的制备方法。

背景技术

细胞生物治疗是运用自身免疫系统的新型癌症治疗方法，是一种具有显著疗效的治疗模式。它运用分子生物学技术和细胞工程学技术，用生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞在体外进行培养和扩增，再回输到病人体内，从而激发、增强机体自身的免疫功能，达到监视并杀灭病变细胞或修复受损细胞的目的。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)属于粒状淋巴细胞，是机体重要的免疫细胞。二般认为NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。与其他淋巴细胞相比，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，无需抗原预先致敏，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，而嗜天青颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关，故NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞等，因此NK细胞可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞。这意味着NK细胞在机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节中会起到重要的作用。

CD244是由CD244基因编码的人蛋白质，又称为NK细胞受体2B4，是一个NK细胞重要的表面受体。NK细胞通过CD244受体激活细胞毒性功能。

CAR意为嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)，当CAR结构与肿瘤相关抗原抗体融合表达在NK细胞的细胞膜表面时，能够赋予NK细胞特异性识别对应肿瘤细胞的能力，此时的NK细胞即为CAR-NK细胞。一个完整的CAR结构通常包括上膜信号区、抗体区(通常来源于对应单克隆抗体的scFV段)、胞外校链区、跨膜区、胞内信号区。通过基因修饰过的NK细胞(CAR-NK)能够对带有其针对的抗原的细胞产生特异性更强的细胞杀伤作用，从而能够达到对肿瘤等治疗的效果。

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-l)来源的一种病毒载体，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果，是外源基因常用载体形式之一。其基本过程就是携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒载体在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肿瘤细胞、干细胞、心肌细胞等多种类型的细胞。使用慢病毒载体能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。

目前，尚未建立一种有效的CAR-NK细胞制备的方法及其在肿瘤免疫治疗方面的应用先例。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用。