[发明专利]基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法。该试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有副猪嗜血杆菌，并测定其含量。本发明具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，可实现副猪嗜血杆菌病诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

技术领域

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌。在一定条件下可引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，该病原引起的疾病又称为格氏病。副猪嗜血杆菌有15个以上血清型，血清1、5、10、12、13和14型是引发猪发病和死亡的强毒血清型；血清型2、4和15是可引起多发性浆膜炎的中等独立型；血清型8属于弱毒力型，血清型3、6、7、9和11为不引起临床症状的无毒力型，我国以血清4和5型流行最多。副猪嗜血杆菌病死亡率较高，病发后不易治愈，病死率高达50％。该病传染性强，且多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康。该病在我国已呈现出流行趋势，给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，建立早期快速检测方法对副猪嗜血杆菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。

目前，实验室常用的检测副猪嗜血杆菌的方法有细菌分离、血清学诊断技术(补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。

数字环介导等温扩增技术(digital loop-mediated isothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其他非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。

为了解决上述传统方法检测副猪嗜血杆菌面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，能够应用于副猪嗜血杆菌的快速、精准检测。

本发明的第一个技术目的是提供用于检测副猪嗜血杆菌的特异性引物，其核苷酸序列分别：

外引物F3：TAATCGGTGATAGCATTGGTC(SEQ ID NO：1)；

外引物B3：CACCTAACATGAATTGATGAGC(SEQ ID NO：2)；

内引物FIP：GCAACATTATAGTTAGCACCTAACGGCATCTTCTGATTCAGCAATT(SEQ ID NO：3)；