[发明专利]基于数字LAMP技术检测阪崎肠杆菌的引物及试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字LAMP技术检测阪崎肠杆菌的引物及其试剂盒与方法。试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有阪崎肠杆菌，并测定其含量。本发明具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，可为婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测提供有效分析手段。

技术领域

本发明涉及一种阪崎肠杆菌测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测阪崎肠杆菌的试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性、依靠周生鞭毛运动、无芽孢兼性厌氧菌。该菌可导致新生婴儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症。虽然发病率较低，但感染该菌的新生儿病死亡率高达40％～80％。婴幼儿食品中由阪崎肠杆菌污染所引起的婴儿感染已经引起全球的广泛关注，阪崎肠杆菌具有较强的繁殖能力，婴儿配方食品中极微量的污染(＜3CFU/100g)就可能大量繁殖。因此需要建立婴幼儿食品中阪崎肠杆菌的快速、灵敏和特异的检测方法。

目前，食品中阪崎肠杆菌的检测方法有传统方法(细菌分离)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统细菌分离方法主要采用食品安全国家标准GB4789.40－2016《食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》，该方法以生化鉴定为主，检测周期长，而且检测结果受检测人员的主观因素影响，特异性和灵敏度均不高。分子生物学检测技术为阪崎肠杆菌的检测提供了一种快速的方法，但PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。

数字环介导等温扩增技术(digital loop-mediated isothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其它非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。

为了解决上述传统方法检测阪崎肠杆菌面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术，并实现检测试剂商品化，这将对婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染的防控带来极大便利。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种数字LAMP技术检测阪崎肠杆菌的试剂盒，能够应用于婴幼儿食品中阪崎肠杆菌的快速、精准检测。

本发明的第一个技术目的是提供用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物，其核苷酸序列分别：

外引物F3：CGTTCTGTTCAACTTCAACAA(SEQ ID NO：1)；

外引物B3：AAGCCAGTCTCTGAACTTATTC(SEQ ID NO：2)；

内引物FIP：TAGTCAACAACAGACTGAGCACGGACGGTTCTGTAGTGG

TTC(SEQ ID NO：3)；