[发明专利]人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将基因HLA-F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)-HLA-F；

(2)将质粒pCzn1(+)-HLA-F转入表达菌株，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株；之后采用IPTG进行诱导表达，得到目标蛋白HLA-F包涵体；

(3)对步骤(2)所述目标蛋白HLA-F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA-F蛋白；

(4)利用步骤(3)所述纯化后HLA-F蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆；

(5)筛选经步骤(4)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理后，即得所述人HLA-F单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表达菌株为大肠杆菌TM；

将所述质粒pCzn1(+)-HLA-F转入所述表达菌株的具体操作如下：

量取1μl含质粒浓度100ng/μl的质粒水溶液，加入到100μl含细胞数为5×10⁶个的感受态表达菌株CaCl₂悬浮液中，置于冰上20min；之后在42℃热敷90s，再迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液；33℃、220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，33℃倒置培养过夜，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株；

采用IPTG诱导表达的具体操作如下：

取LB平板上具有氨苄西林抗性的单克隆菌株接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，33℃、220r/min振摇过夜；次日按体积比1:100接种于含50μg/ml氨苄青霉素的30mlLB培养液中，33℃、220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，33℃、220r/min振摇4h，诱导表达目标蛋白HLA-F，10000r/min室温离心2min，弃上清，即得目标蛋白HLA-F包涵体。

3.根据权利要求1所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，对所述目标蛋白HLA-F包涵体进行变复性处理的具体操作如下：

将所述目标蛋白HLA-F包涵体重悬于20ml裂解液，超声破碎后，4℃10000r/min室温离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液洗涤沉淀3次；用溶解缓冲液溶解沉淀，所述溶解缓冲液与所述沉淀的体积为10:1，4℃放置过夜，室温，10000r/min离心15min，得到上清液在搅拌条件下缓慢滴加至含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的缓冲液中，得到蛋白溶液装入透析袋于含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的溶液中透析过夜，得到变复性处理后的HLA-F包涵体。

4.根据权利要求1所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，对所述变复性处理后的HLA-F包涵体进行Ni柱纯化处理的具体操作如下：

利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至镍离子亲和层析柱，先用缓冲液以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；

接着用洗涤液以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；

之后用洗脱液以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集蛋白流出液；

最后将蛋白流出液加入透析袋于含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的溶液中透析过夜，得到纯化后HLA-F蛋白。