[发明专利]基于数字LAMP技术检测猪链球菌的引物及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字LAMP技术检测猪链球菌的引物和试剂盒及方法。试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有猪链球菌，并测定其含量。本发明具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，可实现猪链球菌病诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

技术领域

本发明涉及一种猪链球菌测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测猪链球菌的试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是猪群中一种常见的条件致病菌，其通常在猪的上呼吸道(尤其是扁桃体和鼻腔)、生殖道或消化道内定居，在严重时感染猪会出现脑膜炎、败血症、肺炎及关节炎等病症，可导致青年猪猝死。根据链球菌菌体荚膜抗原特性的不同，猪链球菌可以分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1，2，7，9型是猪的致病菌。猪链球菌还能感染人类，感染后也会出现脑膜炎、败血症、肺炎、关节炎、心内膜炎、腹膜炎及眼内炎等严重病症，甚至会引起死亡，严重威胁到人类健康和公共卫生。1968年丹麦首次报道人感染猪链球菌，随后南亚、北欧等国家和地区也相继出现了人感染猪链球菌的报道。距今为止，该病已报道超过700例，全球范围内几乎所有养猪国家和地区均有猪链球菌病的报道，其中主要分布在亚洲地区。根据《中华人民共和国动物防疫法》及其相关规定，猪链球菌病为二类动物防疫病。该病的传播对我国食品安全、畜牧业生产安全以及相关从业人员也带来巨大的威胁。因此，加强对猪链球菌检测技术的研究，开展猪链球菌的检测，防止猪链球菌的传入传出，对进出口贸易的技术保障具有重要意义。

目前，实验室常用的检测猪链球菌的方法有细菌分离、血清学诊断技术(凝集反应和酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。

数字环介导等温扩增技术(digital loop-mediated isothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其他非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。

为了解决上述传统方法检测猪链球菌面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种数字LAMP技术检测猪链球菌的试剂盒，能够应用于猪链球菌的快速、精准检测。

本发明的第一个技术目的是提供用于检测猪链球菌的特异性引物，其核苷酸序列分别：

外引物F3：CGTCTTGACTGGTCTTCC(SEQ ID NO：1)；

外引物B3：TTACCAGAACCTGAGATAAGGA(SEQ ID NO：2)；