[发明专利]一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法

说明书

本发明涉及动物基因工程疫苗领域，尤其涉及一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法。该方法包括以下步骤：S1：以狂犬病病毒株rHEP‑Flury为骨架，分别将狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因插入rHEP‑Flury的G基因和L基因之间的假基因区；S2：拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP‑Get‑LTB。该狂犬病病毒重组毒株rHEP‑Get‑LTB具有良好的复制能力以及安全性，通过Get和LTB基因的插入增强了疫苗株的免疫原性和黏膜免疫反应水平，口服免疫后可诱导较高水平的中和抗体，显著优于亲本株rHEP‑Flury，可以作为动物狂犬病口服疫苗的候选株。

技术领域

本发明涉及动物基因工程疫苗领域，尤其涉及一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法。

背景技术

由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的狂犬病(Rabies)是以侵染中枢神经系统为特点的烈性人兽共患传染病，一旦发病致死率几乎高达100％。亚非地区属于狂犬病的高发地，猫、狗等家养动物是携带RABV的主要宿主，约99％的患者是被这些动物咬伤或抓伤后而患病，狂犬病仍是严重威胁这些地区人们生命安全的重要传染病。我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度，高居世界第二位。随着家养宠物的增加，我国狂犬病的控制和防治依然任重道远。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治，所以，安全有效的疫苗是消除我国人间狂犬病的重要手段。

在我国，犬只成为狂犬病的主要带毒宿主和传播源，要想在我国消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70％以上，先在动物中消灭狂犬病。尽管目前针对狂犬病所研发使用的疫苗已经取得了很大的成功，但是很多科研工作者还是通过利用基因操作的优势进行更为优势疫苗的开发研究。针对世界范围内的野生动物及流浪猫狗的免疫仍是预防狂犬病的一大难题。街头流浪动物如猫、狗这些主要传染源很难进行集中的抓捕和免疫，因此，人们考虑了利用口服诱饵对其进行免疫的方法。那么研发出高效且成本低廉的口服疫苗则成为近年来狂犬病疫苗开发的热点。目前在世界范围内已经开发了很多狂犬病口服疫苗并且投入了使用，其主要针对野生动物。第一类口服狂犬病疫苗毒株是是一种金丝雀痘狂犬病糖蛋白重组疫苗，它也被发现对动物有效(TaylorJ,Meignier B,Tartaglia J,et al.Biological and immunogenic properties of acanarypox-rabies recombinant,ALVAC-RG(vCP65)in non-avian species[J].Vaccine,1995,13(6):539-549)。第二类是表达Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株的糖蛋白的牛痘—狂犬病病毒糖蛋白重组病毒。据报道，在美国，加拿大和其他一些国家，此疫苗的使用已经基本实现了对野生动物狂犬病的遏制或消除(Slate D,Rupprecht C E,Rooney J A,et al.Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the UnitedStates[J].Virus Research,2005,111(1):68-76)。第三类是通过利用抗糖蛋白单克隆抗体从SAD Bern株突变而成的SAG2，该毒株在实验动物中不产生临床疾病，并且所有接种过的狗和浣熊显示出免受RABV毒性攻击的保护(Cliquet F,Gurbuxani J P,Pradhan H K,etal.The safety and efficacy of the oral rabies vaccine SAG2in Indian straydogs[J].Vaccine,2007,25(17):3409-3418)。第四类是表达RABV糖蛋白的重组伪狂犬病毒，其在犬类中表现出良好的安全性和免疫原性(Yuan Z,Zhang S,Liu Y,et al.Arecombinant pseudorabies virus expressing rabies virus glycoprotein:safetyand immunogenicity in dogs[J].Vaccine,2008,26(10):1314-1321)。最后一类是E1和E3基因位点都缺失的重组腺病毒毒株。这种表达狂犬病糖蛋白的重组腺病毒可诱导犬、臭鼬和浣熊产生中和抗体(Fehlner-Gardiner C,Rudd R,Donovan D,et al.Comparing ONRAB(R)AND RABORAL V-RG(R)oral rabies vaccine field performance in raccoons andstriped skunks,New Brunswick,Canada,and Maine,USA[J].Journal of wildlifediseases,2012,48(1):157-167)。虽然目前有多种的狂犬病口服疫苗被研究出来，但多数用于动物的口服狂犬病疫苗通常激起较低的中和抗体水平，并且有时在犬中能够达到保护性中和抗体水平的比例很低(Rupprecht,C.E.,Hanlon,C.A.,Blanton,J.,et al.Oralvaccination of dogs with recombinant rabies virus vaccines.Virus Research[J].2005,111:101-105)。所以如何提高狂犬病口服疫苗的免疫原性以及安全性仍然是当前狂犬病疫苗的主要研究方向。