[发明专利]一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法

说明书

本发明公开了一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。本发明以SMV HC‑Pro基因作为靶标基因，对国内外SMV流行株系进行多重核苷酸序列比对，在保守区间内确定了gRNA靶点序列，构建了CRISPR/Cas9基因组定点编辑载体，进一步应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，获得一批阳性转基因材料，通过SMV抗病鉴定、qRT‑PCR、DAS‑ELISA血清学实验，分别从表型水平、RNA水平和蛋白水平研究了T₁代大豆植株对SMV的抗病情况，筛选出一批抗性大豆材料。本发明在大豆SMV抗性机制的研究和抗病育种中具有重要的理论意义和实用价值。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。

背景技术

由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)引起的大豆花叶病毒病是一种全球性大豆病害，广泛分布于世界各大豆产区，严重影响大豆的产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，大豆花叶病毒种。大豆感染SMV后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。

CRISPR/Cas9技术是近年新兴起的一种高效、精准、特异的基因组靶向修饰技术，能够利用序列特异性核酸酶实现基因组的靶向切割和特定位点的插入、缺失、突变或替换，为基因功能的鉴定、作物性状的定向改良提供了新的有效手段。近些年来，科学家们已经成功地将CRISPR/Cas9技术应用于大豆研究当中，包括敲除外源绿色荧光蛋白基因(gfp)和除草剂抗性基因(bar)，敲除内源功能基因(如GmFEI2、GmSHR、GmFT2a、GmPDS11或GmPDS18)，开发快速识别大豆基因组中靶位点及限制性酶切位点的在线网络工具等。但上述研究均未涉及大豆花叶病毒病抗性的改良。

发明内容

本发明的目的是提高大豆对大豆花叶病毒的抗性。

本发明首先保护一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法，可为使大豆含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；

所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。

上述方法中，所述使大豆含有CRISPR-Cas9系统具体可通过向大豆中导入含有CRISPR-Cas9系统的载体实现。

上述方法中，所述大豆可为大豆花叶病毒感病品种。

上述方法中，所述大豆具体可为大豆品种Jack。

上述方法中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。

上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。

上述方法中，所述CRISPR-Cas9系统还可含有Cas9蛋白的编码基因。

本发明还保护一种含有sgRNA的CRISPR-Cas9系统；所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。

上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。

上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。