[发明专利]一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法

说明书

本发明公开一种L‑酪氨酸基因工程菌及其生产L‑酪氨酸的方法，所述基因工程菌敲除了L‑苯丙氨酸合成酶基因pheA及其调控基因pheL，将木糖启动子PxylF控制的T7噬菌体RNA聚合酶整合到lacZ位点，将由T7启动子控制的tyrA(M53I,A354V)‑tyrB整合到tyrR位点，T7启动子控制的aroG(S180F)整合到yghX假基因位点。利用该菌株进行摇瓶发酵24h可积累L‑酪氨酸6.8g/L，在5L发酵罐中发酵30h产量可达37.8g/L。所述基因工程菌不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素，同时使用木糖诱导关键酶基因的高效表达，降低了生产成本，避免了IPTG等诱导剂对细胞的伤害，所述生产L‑酪氨酸的方法简单、可控性强，适合于工业化大规模生产。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法。

背景技术

L-酪氨酸(L-β-对羟苯基-β-丙氨酸；(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸)属于芳香族氨基酸，是人体的条件必需氨基酸，它常作为营养补充剂及L-多巴、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料被广泛用于食品、饲料、医药和化工等行业。L-酪氨酸的生产方法包括蛋白水解法、化学合成法、酶法和直接发酵法。传统的L-酪氨酸生产方法主要是蛋白水解法和酶法，但这些方法存在诸多缺点，如原料来源有限、反应过程中酶活性和稳定性差、工艺繁琐、产品成分复杂等。而微生物直接发酵法生产氨基酸具有原料来源广泛、反应温和、操作简单等优势。随着代谢工程技术的不断发展，对微生物中L-酪氨酸的合成途径进行合理设计和优化以实现L-酪氨酸的发酵生产成为研究热点。

目前，L-酪氨酸的合成途径和调控机制以大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中研究的最为清晰，其代谢途径改造主要集中在解除途径调控、增加前体供应、阻断竞争途径和调节转运系统等几个方面。虽然已报道的关于L-酪氨酸代谢工程的研究已经充分阐释了其代谢途径中的关键基因、调控机理和改造靶点等，但L-酪氨酸的发酵生产依然存在产量低或糖酸转化率低的问题，且目前还没有成熟的发酵法生产技术来进行L-酪氨酸的工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-酪氨酸基因工程菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种利用上述基因工程菌生产L-酪氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是：

一种L-酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，阻断竞争途径苯丙氨酸合成途径，解除关键酶的反馈抑制和转录负调控，并利用木糖启动子诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，结合T7强启动子系统启动关键酶基因的高效表达。

所述基因工程菌敲除了L-苯丙氨酸合成酶基因pheA及其调控基因pheL，将木糖启动子PxylF控制的T7噬菌体RNA聚合酶整合到lacZ位点，将由T7启动子控制的tyrA(M53I,A354V)-tyrB整合到tyrR位点，T7启动子控制的aroG(S180F)整合到yghX假基因位点。

本发明的技术方案之二是：上述基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术，以E.coli W3110为出发菌株，敲除pheLA基因；

(2)构建木糖启动子PxylF和T7RNA聚合酶T7RNAP的连接片段，并将其整合至lacZ位点；

(3)构建PT7启动子和tyrA(M53I,A354V)-tyrB的连接片段，并将其整合至tyrR位点。

(4)构建PT7启动子和aroG(S180F)的连接片段，并将其整合至yghX假基因位点；

本发明的技术方案之三是：利用上述基因工程菌生产L-酪氨酸的方法。