[发明专利]用于筛选低蛋白酶A基因表达的酵母菌株的多重引物、试剂盒及筛选方法

权利要求书

1.一种利用多重引物筛选低蛋白酶A基因表达的酵母菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以酵母菌株总RNA为模板依次进行反转录合成cDNA模板、多重PCR扩增反应、毛细管电泳分离，并利用GeXP系统对毛细管电泳分离结果进行分析；

以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量，根据蛋白酶A基因的表达量判断酵母菌株为低产蛋白酶A菌株、中产蛋白酶A菌株或高产蛋白酶A菌株；

所述多重引物包括根据酵母蛋白酶A关键基因PEP4的同源基因PEP4-Sc和PEP4-Sb分别设计特异性上下游引物，包括：

；

所述内参基因包括ACT1的同源基因ACT1-Sc、ACT1-Sb，根据内参基因设计特异性上下游引物，包括：

；

以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量的计算和判断方法为：

PEP4-Sc基因表达量=PEP4-Sc峰面积/[（ACT1-Sc峰面积+ACT1-Sb峰面积）/2]

当蛋白酶A基因表达量£3时，判定酵母菌株为低产蛋白酶A菌株；当3蛋白酶A基因表达量10时，判定酵母菌株为中产蛋白酶A菌株；当蛋白酶A基因表达量≥10时，判定酵母菌株为高产蛋白酶A菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以酵母菌株总RNA为模板、以序列SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的下游引物为特异性引物反转录合成cDNA模板第一链。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录合成cDNA模板的反应参数设置为：48℃，1 min；42℃，60 min；95℃，5 min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以合成的cDNA模板第一链为模板、以序列SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的上游引物为特异性引物进行多重PCR扩增反应。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的参数设置为：95℃预变性10 min；94℃变性30 s；退火温度55℃，30 s；70℃延伸1 min，整个PCR扩增反应过程循环35次。