[发明专利]一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法

说明书

本发明公开了一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其包括如下步骤：矿化液的准备、三维微球的制备、细胞微球的矿化以及材料补充手段，所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法设计流程合理，其通过生物学培养的方法，进行三维矿化基质培养细胞微球，与传统的体外二维培养的细胞相比，本发明所培养的细胞包含了更多的细胞生物学信息，有很好的仿生模拟骨组织的形成过程，所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法值得在生物医学领域推广与使用。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体是一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法。

背景技术

骨组织是由成骨细胞分泌细胞外基质,并通过类顶浆方式向细胞外基质分泌基质小泡,小泡中含有矿物质离子,基质小泡在酶的作用下破裂后将矿物质释放到细胞外基质后,在非胶原蛋白的作用下,以纳米羟基磷灰石的形态沉积在胶原纤维中,形成骨的基本结构,矿化胶原纤维，骨的再生和修复一直是医学研究的重点方向。

近年来,体外模拟骨的形成过程,成为研究者们迫切想解决的问题,因为骨组织是完整的三维形态,体外的所使用的细胞大部分为二维培养,丢失许多细胞信息，并未很好的仿生模拟骨的形成过程。

针对背景技术中所提到的问题，本发明旨在提供一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其包括如下步骤：矿化液的准备、三维微球的制备、细胞微球的矿化以及材料补充手段，所述矿化液的准备实施方式为将4.2mM的K2HPO4加入完全培养基形成矿化培养基A,将9mM的CaCl2和0.2mg/ml的聚天冬氨酸加入完全培养基中形成矿化培养基B；所述三维微球制备实施方式为将大鼠来源骨髓间充质干细胞(P3)接种于三维培养板中；所述细胞微球的矿化实施方式为：将三维培养板中的微球放置于矿化培养基进行培养；所述材料补充手段实施方式为采用扫描电镜(SEM)和能谱分析仪(EDX)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分、采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能、微球内细胞活性的检测、微球内细胞分布的检测以及通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力。

作为本发明进一步的方案：所述完全培养基由如下成分配置：20％牛血清,100U/ml青霉素/链霉素,2mM谷氨酰胺,α-MEM培养基,55μM的2-甲氧基雌二醇以及55μM的地塞米松磷酸钠，所述α-MEM培养基为本领域技术人员公认常识培养基；所述三维微球的制备具体实施方式为：接种于三维培养板中的大鼠来源骨髓间充质干细胞(P3),于37℃,5％的CO₂的敷箱中完全培养基培养24h后得到微球形态的细胞团块(CS)；所述细胞微球的矿化具体实施方式为：所述矿化培养基由矿化培养基A与矿化培养基B 1:1混合制成,所述混合溶液中Ca²⁺浓度为4.5mM,PO4^3-浓度为2.1mM，混合后的矿化培养基培养细胞培养板中的微球,24h后得到矿化细胞外基质干细胞微球(MECS)。

作为本发明进一步的方案：所述采用扫描电镜(SEM)和能谱分析仪(EDX)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分具体实施方式为：将培养5天后的不同细胞微球经3.7％多聚甲醛固定后,经梯度酒精脱水(50％－100％)，喷金后，在15kV电压下观察；所述采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能具体实施方式为：在室内常规环境下的测量中，采用Derjaguin–Muller–Toporov(DMT)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量。每组选用2个样本，每个样本选择3个图，每个图中选5个点，这样每组共30个数据，并采用Anova方差分析。