[发明专利]制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法

说明书

本发明涉及一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法，该制备方法采用含尿苷的料液为底物，加入具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大肠杆菌细胞破碎液、六偏磷酸钠、硫酸镁和少量ATP，在pH 8.0，温度30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸。在上述偶联催化反应体系中，尿苷激酶负责催化尿苷和ATP生成尿苷酸，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP。聚磷酸激酶负责催化六偏磷酸钠和ADP形成ATP，从而实现反应中ATP的再生。本发明提供的尿苷酸生产方法具有原料价格低廉，周期短，操作简便，绿色环保，产率高的优点，具有良好的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及化合物生物技术生产领域，具体涉及一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法。

背景技术

尿苷酸是一种重要的核苷酸产品，可作为食品添加剂、药品以及药物前体应用于不同领域。作为母乳中含量第二大的核苷酸，它是婴幼儿食品中常用的添加剂；能参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸苷的合成，也可作为膜磷脂的前体提高脑部胞苷二磷酸胆碱和乙酰胆碱水平；以其为前体的碘苷也已广泛应用于临床。

现有的尿苷酸的生产方法主要为化学合成法和酶解法。

化学合成法包括磷酸化法和脱氨法，其中是磷酸化法(201410334268.9)是以尿苷为原料，将2，3位的羟基保护后，再使用有毒的POCl₃试剂作为磷酸化试剂合成尿苷酸，整个过程收率较高但是生产安全性差，容易造成污染且杂质较多。脱氨法(ZL201110116164.7，ZL201310442551.9)是以胞苷酸为原料，在酸性条件下经过脱氨反应，将胞苷酸直接转变为尿苷酸，整个过程简单高效，但由于原料胞苷酸价格昂贵，生产成本较高。

酶解法(Bioresource Technology,2003,88(3):245-250)是利用核酸酶水解核糖核酸(RNA)得到四中单核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸)混合物后，再经过离子交换法分离精制得到尿苷酸。与化学法相比，酶解法具有原料成本低、反应安全、反应条件温和等有点，但是存在生产周期长，分离精制工序复杂，加工成本高等缺陷。

除了化学合成法和酶解法之外，也有研究者使用来自大肠杆菌或保加利亚乳杆菌的尿苷激酶以尿苷为底物催化合成尿苷酸(Journal of Biotechnology,2014,188:81–87)。该方法转化周期较短，尿苷酸收率较高，但是使用的尿苷激酶高度依赖GTP作为磷酸供体，而GTP价格昂贵且再生成本较高。鉴于现有技术存在的不足，特提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法，两种工程菌发酵获得酶可直接催化尿苷溶液或尿苷发酵液得到产品，原料成本低廉，产物单一易于分离纯化，尿苷酸产量和摩尔转化率具有显著优势。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种制备尿苷酸用转化制剂，包括尿苷激酶和聚磷酸激酶，所述尿苷激酶的氨基酸序列见序列1，所述聚磷酸激酶的基因序列见序列3；或所述聚磷酸激酶的基因序列见序列4。

一种尿苷酸制备的方法，具体操作如下

(1)将工程菌进行破碎获得粗酶液，获得具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的粗酶液；(2)获得的粗酶液与50-150mM的尿苷溶液或尿苷发酵液、50-150mM的六偏磷酸钠、50-150mM的硫酸镁、3-9mM的ATP混合，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸，工程菌分别表达权利要求1所述尿苷激酶和聚磷酸激酶；

所述工程菌以pET-his质粒为载体在E.coli BL21中过表达权利要求1所述尿苷激酶；所述工程菌以pET-28a质粒为载体在E.coli BL21中过表达利要求1所述聚磷酸激酶；

所述工程菌的培养方法为：