[发明专利]用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿EVs生物标志物

说明书

本发明提供一种用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物，以及诊断糖尿病肾病早期阶段的方法。所述生物标志物为尿液细胞外囊泡(urine extracellularvesicles,尿EVs)内含的MASP2，其在糖尿病肾病早期阶段表达量相对于正常人显著升高。本发明的诊断方法是非侵入式的，有着巨大应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及糖尿病肾病早期阶段的尿EVs生物标志物的检测。

技术背景

糖尿病已成为全球公共卫生问题。2015年，国际糖尿病联盟(InternationalDiabetes Federation,IDF)宣布，中国有1.096亿糖尿病患者，多数为2型糖尿病，在其血糖达到糖尿病诊断标准之前先出现空腹血糖受损和/或糖耐量异常，称之为糖尿病前期(又被称为前糖尿病)。这些患者尽管没有明显的血糖升高，但是已经开始出现器官损害，因此对其早期诊断有极其重要的意义，能更有效地防止糖尿病并发症的发生。糖尿病肾病和肾衰竭是糖尿病常见的并发症，目前确诊糖尿病肾病依靠肾脏活检穿刺，但这是一种有风险的有创性检查。微量白蛋白尿可以诊断糖尿病肾病第3期，但当糖尿病肾病还处在第1,2期时，尿中还未出现微量白蛋白，这时如何诊断早期糖尿病肾病目前依然是国际上本领域研究的重点和难点。目前国内外还没有公认的能在微量白蛋白尿出现之前早期诊断糖尿病肾病的尿液生物标志物。

尿液细胞外囊泡(extracellularvesicles，EVs)源自整个泌尿生殖道的多种细胞，释放到尿液中，并且可以作为肾功能障碍和结构损伤的生物标志物。

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症，显著增加心血管风险和相关死亡率。尿液细胞外囊泡(EVs)被认为不仅仅是肾损害标志物的丰富的非侵入性来源，也是全身器官或者是血管损伤的重要标志物来源。本发明作者试图验证尿EVs中的某些蛋白可能与糖尿病肾病存在关联。

生理状态下尿液中存在大量高丰度蛋白，例如Tamm-Horsfall蛋白，而能够反映疾病早期信息的尿液中的蛋白常常是低丰度的，由于受到其他高丰度蛋白的影响，很难被特异敏感地检测出来。有意义的是，这些反映疾病早期信息的尿液蛋白质很多存在于尿液的EVs中，如果我们能够找到科学有效的富集尿 EVs的方法，然后检测尿EVs中的能够反映疾病早期信息的蛋白质，就能克服尿液中高丰度蛋白的影响。在本发明研究中，我们试图在尿液EVs中寻找并验证一种重要的生物标志物，最终可以对其进行评估或监测，以达到DN早期诊断的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液EVs内含蛋白，用于在尿液出现微量白蛋白之前早期诊断糖尿病肾病早期阶段。

我们假设在患有糖尿病肾病(DN)的患者的尿液EVs中可以发现不同的蛋白质，特别是在微量白蛋白尿出现之前。本项研究中，用于DN患者尿EVs研究的大量尿液样本是在本课题组在南方社区人群开展ISN“KHDC”项目支持的社区分子流行病学研究中获得的。在本研究中，采用双向电泳技术分离来自患有DN 和健康受试者的患者的尿液EVs，并且通过MALDI TOF/MS分析对其蛋白质组分进行分析和定量比较。

通过电泳技术分离出患者尿液EVs中1980个蛋白斑点，其中40个蛋白斑点与NC组相比有至少1.5倍的显著性差异。对上述40个蛋白斑点进行质谱鉴定，发现其中22种蛋白质可能与糖尿病肾病密切相关。

对上述差异蛋白质进行文献检索，中文文献中仅发现有2篇文章描述人甘露糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶-2(Mannan-binding lectinassociated serineprotease 2，MASP2)在人的糖尿病慢性肾脏疾病、糖尿病肾病中的表达，但也只是局限于血浆、血清中的研究；仅有1篇研究MASP2在糖尿病模型大鼠肾组织的表达，都不涉及尿液EVs中MASP2与糖尿病/糖尿病肾病的相关性。而英文文献中，MASP2在糖尿病、糖尿病肾病中尚未见相关研究。