[发明专利]一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体

权利要求书

1.一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法，其特征在于，包括：

（1）构建同源重组载体，获得插入片段；所述插入片段包括斑马鱼心脏特异表达的启动子、融合LoxP位点序列的左侧同源臂和右侧同源臂、内部核糖体进入位点、报告基因、转录终止信号片段以及位于所述启动子和报告基因之间的多克隆位点，所述的左侧同源臂和右侧同源臂之间依次设有以下元件：斑马鱼心脏特异表达的启动子、多克隆位点、内部核糖体进入位点、报告基因和转录终止信号片段；其中，所述启动子位于报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游，同源臂的内侧含有LoxP序列；左侧同源臂和右侧同源臂靶向斑马鱼色素基因；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述的报告基因为荧光报告基因EGFP，序列为SEQ IDNO.22；所述的内部核糖体进入位点为IRES2，序列为SEQ ID NO.28，所述的转录终止信号片段为SV40 polyA；所述斑马鱼色素基因为斑马鱼Tyrosinase基因，靶点序列为SEQ IDNO.1；所述左侧同源臂的序列为SEQ ID NO.2，所述右侧同源臂的序列为SEQ ID NO.3；

（2）设计针对同源臂靶向基因的特异性靶点，合成相应的sgRNA，合成Cas9-mRNA；

（3）将所获得sgRNA、Cas9-mRNA和插入片段转入斑马鱼受精卵中，筛选转基因斑马鱼；步骤（3）中，在斑马鱼发育至24hpf早期心脏搏动开始，即可以筛选获得心脏表达EGFP基因的阳性个体，24hpf后由于色素基因被阻断表达，阳性个体无色素沉积，利于心脏在体观察检测；在斑马鱼成年后，筛选实验需求的特定心脏表型，通过Cre酶特异性将LoxP位点之间引入的外源序列删除，恢复色素基因的表达，达到调控插入基因表达的目的，恢复无外源基因插入的斑马鱼群体。