[发明专利]固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸

说明书

本发明公开了一种制备β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)的新方法，以D‑5‑磷酸核糖、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化，实现了高效生物合成β‑烟酰胺单核苷酸，合成β‑烟酰胺单核苷酸的浓度达到13.3g/L。提高β‑NMN的酶法合成量和转化率，固定化全细胞的反复使用，降低反应复杂度和生产成本。

技术领域：

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，尤其涉及固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸。

背景技术：

β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶催化后得到的产物，在体内有着重要的作用，是NAD⁺的关键前体之一。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《science》上的一项研究表明，NAD⁺在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD⁺分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD⁺的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了“不老神药”。这也促使全球各大医药和食品界不断的对NMN进行开发，目前大部分β-NMN来源于化学法合成，造成严重的环境污染以及带来高成本；用有机溶剂合成保健品药物，难除净小分子有机物，对人体存在潜在危险。正因如此，生物转化制备β-NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。

在酶法制备β-NMN的研究中，也有一些专利，如：WO2018023209、WO2018023210、CN106755209，公开了酶法合成技术，但是它们所涉及的合成方法相对比较复杂，需要多步反应，且转化率和收率普遍不高。

针对现有技术中所存在的缺陷，本发明公开了一种高效的β-NMN的酶法合成方法，可以有效降低反应复杂度和生产成本。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是针对目前化学合成法存在的弊端和现有生物酶法催化的复杂性，开发一种简单的一步酶法制备β-NMN，有效降低反应的复杂性，提高实验可操作性及ATP的转化率。

本发明技术方案如下：

一种一步酶法催化合成β-NMN，工艺路线如式I所示：

以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为底物，在ATP存在下，用固定化含有磷酸焦磷酸合成酶(PRPPs)和烟酰胺焦磷酸转移酶(NAMPT)的基因工程菌全细胞催化，一步实现β-NMN的生物合成。

进一步，反应步骤包括：

a.用10-50mM的磷酸盐缓冲液溶解D-5磷酸核糖、烟酰胺和ATP，MgCl₂的浓度为1-50mM，MnSO₄的浓度为1-100mM。

b.搅拌条件下用磷酸与饱和氢氧化钠溶液调pH至7.0-8.5。

c.D-5磷酸核糖和烟酰胺溶解后，向反应釜中投入固定化全细胞，控制固定化全细胞在在20-50g/L，反应温度控制在30-45℃。

d.搅拌反应过程中用5-20％的K₂CO₃溶液控制pH在7.8-8.5，3h后离心收集上清液，进行HPLC分析。

本发明的有益效果：全细胞催化剂或者共表达细胞催化剂具有成本低、生产工艺相对简单、辅酶用量少等优点。共表达细胞催化剂菌株的构建利用了分子生物学技术，将两个酶(PRPPs和NAMPT)同时克隆到一个细胞中，不仅具有使用价值，而且技术难度高。将共表达细胞进行固定化，得以实现固定化全细胞催化，使得细胞可以反复利用，从而进一步降低生产成本，突显生物催化路线的优势。