[发明专利]一种菌种筛选及优化方法

权利要求书

1.一种菌种筛选及优化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、配制待测菌液；制作牛肉膏蛋白胨液体培养基，调节pH为7，分装于锥形瓶后，每瓶100mL，放于高温灭菌锅中灭菌；待培养基温度降至室温后，挑取一环菌种接种于种子液培养基中，于30摄氏度，120r/min振荡培养箱培养24小时后制成种子液；再按1％(v/v)的接种量，从种子液中移取1mL，接种于新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基中，再于30摄氏度，120r/min振荡培养箱培养24小时，制成待测菌液；

步骤2、绘制对硝基苯酚标准曲线；称取对硝基苯酚0.0417g，用超纯水溶解后在容量瓶中定容至100mL，制成3mmol/L的标准曲线母液；取10支试管，对硝基苯酚标准曲线溶液配比表中比例加入混匀，空白对照采用同体积无菌水；在室温下吸光度为400nm处测定待测物吸光度值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制对硝基苯酚标准曲线；

步骤3、测定菌种酶活；在玻璃比色皿中依次加入1.9mL的Tris-H₂SO₄缓冲液、0.1mL待测菌液和1.0mL乙酸对硝基苯酯溶液，于室温下反应5min后于400nm吸光度处用紫外分光光度计测定其吸光值OD400，空白对照加无菌培养基；按照标准曲线，得出线性回归方程，算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活；

步骤4、测定菌种生长；使用紫外分光光度计测定培养24小时后的待测菌液的OD600值；空白对照采用无菌培养基；

步骤5、温度对菌种生长的影响：在接种量为1％(v/v)的条件下，种子液制作方法如步骤1所示，将筛选出的供试菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基后，调节pH为7，放于20℃、25℃、30℃恒温培养箱中培养，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、28h、32h、36h用紫外分光光度计测定OD600值，于2h、6h、10h、24h、32h、36h测定菌种酶活；

步骤6、pH对菌种生长的影响：种子液制作方法如步骤1所示，在接种量为1％(v/v)的条件下，将菌种接种于牛肉膏蛋白胨后，调节pH为6-7、8，放于30℃恒温培养箱中培养，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、28h、32h、36h用紫外分光光度计测定OD600值，于2h、6h、10h、24h、32h、36h测定菌种酶活。

2.根据权利要求1所述的菌种筛选及优化方法，其特征在于，步骤1中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：

牛肉膏 3g

蛋白胨 10

NaCl 5g

去离子水 1L。

3.根据权利要求1所述的菌种筛选及优化方法，其特征在于，步骤2得到对硝基苯酚标准曲线回归方程为：y＝4.7272x+0.0089，R²＝0.99885。

4.根据权利要求1所述的菌种筛选及优化方法，其特征在于，步骤5中，恒温培养箱中的培养温度为30℃。

5.根据权利要求1所述的菌种筛选及优化方法，其特征在于，步骤6中，pH为6-7。