[发明专利]采用木质纤维素培养微藻的方法

权利要求书

1.采用木质纤维素培养微藻的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20%，半纤维素含量不高于25%的木质纤维素底物；

（2）糖化：按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤（1）得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；所述纤维素酶制剂通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到；所述纤维小体为由热纤梭菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体；

其中，所述非纤维小体蛋白具体为：由基因组CP001393.1中1968724至1973904核酸序列编码的纤维素外切酶Cel9-48、编码序列为SEQ ID NO: 2的膨胀因子Epn、编码序列为SEQID NO: 1的木聚糖酶XynA和由基因组CP001393.1中2531445至2532785核酸序列编码的果胶酶PelA；

其中，所述纤维素外切酶Cel9-48的3’端与热纤梭菌的I型对接模块DocIct的序列SEQID NO: 6直接连接；所述膨胀因子Epn与脚架蛋白SdbA的5’端进行融合表达，所述脚架蛋白SdbA的序列为基因组CP002416.1中1108113至1109912核酸序列编码；所述木聚糖酶XynA的3’端与II型粘连模块CohII的序列SEQ ID NO: 7直接连接；所述果胶酶PelA的3’端与热纤梭菌的I型对接模块DocIct的序列SEQ ID NO: 6直接连接；

（3）微藻异养发酵：当步骤（2）得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180 g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的微藻种子液，在16-34℃的温度条件下发酵3-5天，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤（2）获得的糖液，使糖浓度维持在5-10 g/L，在16-34℃的温度条件、补氮且6.0-9.0的pH条件下发酵5-10天，获得微藻发酵液；

（4）后处理：将步骤（3）得到的微藻发酵液离心处理，分离藻细胞与发酵后的培养基。

2.根据权利要求1所述的采用木质纤维素培养微藻的方法，其特征在于：还包括步骤（5），具体为：将步骤（4）固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释，用于配制步骤（2）的糖化培养基；所述微藻为具备异养生长能力的单细胞光合微生物，包括微拟球藻、栅藻、小球藻、寇氏隐甲藻、螺旋藻、雨生红球藻；所述微拟球藻、小球藻、螺旋藻和雨生红球藻可采用光周期的方式进行发酵培养。

3.根据权利要求2所述的采用木质纤维素培养微藻的方法，其特征在于：步骤（2）所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、尿素0.8 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁1.8 g/L、硫酸亚铁0.0005 g/L、硫化钠2 g/L、玉米浆4 g/L、柠檬酸三钠2 g/L、pH6.5-7.5；步骤（3）所述的发酵培养基按照质量百分比由以下组分组成：酵母粉0.3%，玉米浆0.6%，磷酸二氢钾0.3%，七水合硫酸镁0.03%，硝酸钠0.3%，其余为水，pH 6.0。

4.根据权利要求2所述的采用木质纤维素培养微藻的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11%，半纤维素含量不高于12%；步骤（2）糖化步骤中的温度条件为55-60℃，水解体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。

5.根据权利要求2所述的采用木质纤维素培养微藻的方法，其特征在于：步骤（3）中，当葡萄糖浓度为60-150g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；在16-30℃的温度条件下发酵3-5天，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束，或者在发酵过程中连续流加步骤（2）获得的糖液，使糖浓度维持在5-10 g/L，在16-30℃的温度条件、补氮且6.0-6.5的pH条件下发酵5-10天；所述补氮操作具体为：流加50%（w/v）的玉米浆溶液进行补氮。