[发明专利]一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒在审
| 申请号： | 201810938968.7 | 申请日： | 2018-08-17 |
| 公开（公告）号： | CN109055504A | 公开（公告）日： | 2018-12-21 |
| 发明（设计）人： | 何军;李颖;邱桥成;鲍晓晶 | 申请（专利权）人： | 苏州大学附属第一医院 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12Q1/6881;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 尹红红 |
| 地址： | 215000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 探针 引物 荧光定量PCR检测 基因序列 检测试剂 阳性DNA 特征性 生物检测领域 引物设计软件 特异性DNA 电泳 割胶 基因分型 基因检测 质粒测序 准确率 比对 测序 菌群 条带 样本 抽取 数据库 筛选 转化 | ||
1.荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针，其特征在于，其序列为：
2DS3F：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGAC-3’；
2DS3R：5’-CCCTGCCAGGTCTTGCC-3’；
荧光探针：5’-ATCGGTCGCATGAGG-3’。
2.获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）抽提正常人DNA样本，运用PCR-SSOP方法进行KIR基因分型，筛选出KIR2DS3阳性的正常人DNA样本；
（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DS3序列特异性引物扩增板进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；
（3）提取KIR2DS3特异性条带中的PCR产物，经割胶、纯化后，与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序；
（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性KIR2DS3基因序列，测序获得的具体序列为：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTG
GAGAGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGAC
CTGGCAGGG；
（5）根据特征性KIR2DS3基因序列，运用引物设计软件，设计出如权利要求1所述的引物及探针。
3.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，PCR扩增采用的仪器为Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪。
4.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，所述步骤（3）中使用的T载体为pMD18-T Vector。
5.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，所述的引物及探针通过primerexpress软件进行设计。
6.权利要求1所述的荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针在制备KIR2DS3mRNA荧光定量PCR检测试剂盒中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，检测KIR2DS3 mRNA的方法包括以下步骤：
（1）提取总RNA；
（2）将RNA逆转录为cDNA；
（3）使用权利要求1中的引物和探针，运用荧光定量PCR通用体系，检测KIR2DS3的mRNA转录水平。
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