[发明专利]一种Ogura CMS萝卜保持系快速选育与创制方法

权利要求书

1.一种分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制的引物对，其特征在于，所述引物对包括特异引物Ⅰ和特异引物Ⅱ，所述特异引物Ⅰ用于检测胞质不育基因orf138，用于对Type A型Ogura CMS萝卜进行鉴定，其正向引物orf138-F序列为：5’-AACGGGAAGTGACAATACC-3’，如SEQ ID NO .1所示，反向引物orf138-R序列为：5’-GTTGACCAACAAAAGCATG-3’，如SEQ ID NO .2所示；所述特异引物Ⅱ用于检测Rfo/rfo等位基因HindⅢ酶切差异位点，用于对Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因Rfo/rfo进行分子标记快速筛选，其正向引物Rf-F序列为：5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTG-3’，如SEQ ID NO .3所示，反向引物Rf-R序列为：5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTC-3’，如SEQ ID NO .4所示。

2.一种Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）采用如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的特异引物Ⅰ对萝卜不育材料DNA进行PCR扩增，扩增特异片段长度为544bp，经测序比对筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本；

（2）提取萝卜优良自交系材料基因组DNA，以步骤（1）所述特异引物Ⅰ进行PCR扩增，选择不能扩增出544bp特异片段的优良自交系材料，采用如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的特异引物Ⅱ对该优良自交系材料DNA基因组进行PCR扩增，扩增特异片段长度为643bp，对扩增产物进行限制性内切酶HindⅢ-HF酶切，酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出酶切能产生3条带358bp、209bp和76bp的材料作为不育系选育的侯选保持材料；

（3）以现有待改良Type A型Ogura CMS保持系为母本，以优良自交系为父本，进行杂交获得F1代材料，然后F1代材料自交获得F2代材料，对F2代材料进行性状鉴定，筛选优良F2代材料，提取筛选的优良F2代材料基因组DNA，用步骤（2）所述方法进行恢复基因分子标记选择，即可快速从创制材料中筛选到候选保持材料；

（4）用步骤（2）所选候选保持材料为轮回亲本与步骤（1）所选Type A型Ogura CMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可选育出优良Type A型Ogura CMS不育系与保持系；用步骤（3）所选候选保持材料为轮回亲本与步骤（1）所选Type A型Ogura CMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可实现Type A型Ogura CMS保持系的快速创制与不育系的改良。

3.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，特异引物Ⅰ的PCR扩增程序为：

1）94℃，4 min；

2）94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；

3）72℃延伸10 min。

4.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（1）中对扩增出的特异片段PCR产物进行测序，根据Ogura CMS胞质分类依据比对测序结果，筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本。

5.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，特异引物Ⅱ的PCR扩增程序为：

1）94℃，4 min；

2）94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；

3）72℃延伸10 min。