[发明专利]重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用

说明书

本发明涉及一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，同源重组法构建外源磷酸胞苷胆碱转移酶基因CCT整合表达载体，并以CCT基因重组的工程菌为载体，成功将外源多肽引入重组的工程菌的体内。本发明的有益效果：实现了CCT的稳定、长久表达，且CCT的表达水平提高了1.5倍左右；与野生型菌株相比，卵磷脂及脂肪酸含量显著提高，电穿孔技术将外源多肽转入菌株胞内，外源多肽因其自身亲脂性而进入重组菌株的脂滴内，实现了外源多肽的成功包裹。小鼠口服整个携带胰岛素的菌株GM4‑CCT‑insulin 7天，发现小鼠血清和重要器官（肝、肺、脾、肾）中insulin的含量增加，糖尿病小鼠口服菌株GM4‑CCT‑insulin，其血糖显著降低，GM4‑CCT‑insulin作为外源性胰岛素具有显著的降血糖的作用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及重组磷酸胞苷胆碱转移酶的粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用。

背景技术

磷脂（Phospholipid）是生物膜的基本成分，在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧，由于水是极性的，当众多的磷脂分子位于水溶液表面时，磷脂与水分子相互作用后通常会形成微团、脂质体、磷脂双层3种形式的磷脂分子复合物结构。多肽类药物都是生物大分子, 其共同特点是在生物体内不稳定,易于被蛋白水解酶降解, 因而在生物体内的半衰期较短,口服给药生物利用率低，且患者依从性差，因而限制了其广泛应用。而用脂质体包裹后, 可克服这些缺点。

真核生物体内其磷脂的合成其起始物为3-磷酸-甘油，3-磷酸-甘油在转酰基酶及磷脂酸酶作用下转变成二酰甘油，而二酰甘油在不同的转酰基酶的作用下合成不同的磷脂。因此，为控制磷脂的合成，可以通过提高转酰基酶的活性而使得磷脂的合成增多。

本实验室前期筛选到的一种炎症前期趋化因子拮抗肽H9，,此拮抗肽可特异阻断炎症前期趋化因子的分泌,生产成本低,特异性强、功效明确,安全可靠，已于2011年申请专利保护，申请号为201110150794.6 。

H22LP也是实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽，H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制人巨细胞病毒的作用。

干扰素 (IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α-(白细胞)型、 β-(成纤维细胞)型，γ-(淋巴细胞)型;同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

Ⅰ型干扰素包括IFN-α与IFN-β等。由人成纤细胞产生的称IFN β；IFN-α主要由单核-巨噬细胞产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α；IFN-β主要由成纤维细胞产生。IFN-α/β二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。

Ⅱ型干扰素：Ⅱ型干扰素即γ干扰素，主要由活化的T细胞（包括Th0、TH1细胞和几乎所有的CD8+ T细胞）和NK细胞产生，是所谓的淋巴因子（LyTnPhokine）的一种。IFN-γ可以以细胞外基质相连的形式存在，故通过旁邻方式控制细胞生长，其可以分布在除成熟红细胞以外的几乎所有细胞表面。

IFN-γ抗菌作用：IFN-γ能通过下调转铁蛋白受体减少细菌供铁量或通过诱导产生内源性NO直接抑制细胞内细菌，还能增加单核巨噬细胞的吞噬小体——溶酶体溶解细菌作用，通过以上途径共同达到消灭细菌的作用。