[发明专利]利用SSR荧光测序技术鉴定酒花纯度的方法

权利要求书

1.利用SSR荧光测序技术鉴定酒花纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取青岛大花和麒麟丰绿以不同比例制备得到的酒花样品混合物的DNA；

(2)选取4对SSR引物进行酒花品种鉴定，对提取样品DNA进行PCR扩增，所述4对引物中的正向引物5'端均用Alexa Fluor 750荧光染料进行标记，

所述4对SSR引物序列如下：

(3)毛细管电泳荧光检测；

(4)数据分析和标准曲线构建；

(5)基于构建的标准曲线，在测定酒花样品混合物时，将不同比例下的麒麟丰绿与青岛大花的峰面积比值代入方程，得出青岛大花的实际纯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系反应体积为20μL，含MgCl₂2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，正向引物0.06μmol/L，反向引物0.20μmol/L，Taq DNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液，所述缓冲液中不含Mg²⁺，样品DNA 20ng。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳荧光检测包括以下几个步骤：

a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μL DSS-400分子量内标，加入39.5μL SLS甲酰胺上样缓冲液，震荡混合均匀，加入样品板中；

b、向样品孔中加入1μL稀释后的PCR产物,加一滴石蜡油覆盖样品；

c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；

d、将样品板和缓冲液板放入GeXP遗传分析系统仪中，操作条件为：进样电压2.0kV，时间30s；90℃变性120s；分离电压6.0kV，时间35min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述数据分析、标准曲线及回归方程构建为：

对GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，统计得出不同酒花样品混合物的SSR标记片段，对比所述SSR标记片段与DSS-400分子量内标，得到SSR标记片段长度大小。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据酒花样品混合物扩增片段的毛细管电泳图谱，将检测峰判读为对应的等位基因，根据等位基因大小进行青岛大花与麒麟丰绿的品种区分；同时，将各检测峰的峰面积记为相对荧光信号，以麒麟丰绿的添加比例为横坐标X，麒麟丰绿与青岛大花的峰面积比值为纵坐标Y建立标准曲线。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，麒麟丰绿的纯度随麒麟丰绿与青岛大花的峰面积比值的增大而增大，随麒麟丰绿与青岛大花的峰面积比值的减小而减小。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，麒麟丰绿的添加量＞1％。