[发明专利]人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种具有强增殖能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞，所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞从人的子宫内膜组织中分离得到。

2.权利要求1所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液，直接接种于间充质干细胞培养基中进行培养及传代纯化，获得所述间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是按照下述步骤进行：

1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/ml DNase I的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol% FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液；

2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块；

3）在所述细胞团块中加入10vol% FBS-DMEM/F12培养基，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

4.权利要求1所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液，采用密度梯度离心法分离得到包含有间充质干细胞的细胞群，接种于间充质干细胞培养基中，进行培养及传代纯化，获得所述间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是按照下述步骤进行：

1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/ml DNase I的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol% FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液；

2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块；

3）分别配制密度为1.048～1.052g/ml，1.058～1.062g/ml，1.070～1.084g/ml的三种含有Percoll和Ads的梯度密度缓冲液，分别记为A液、B液和C液，其中B液以0.01g/l酚红标识；

4）在加有A液的离心管中移入等体积的B液，轻轻插入离心管底部缓慢滴加在A液下方，形成两层液体分离的界面；

5）用与A液等体积的C液重悬步骤2）获得的细胞团块，得到细胞悬液，将所述细胞悬液插入离心管底部缓慢加入在B液下方，形成具有无色-红色-无色三层液体清晰分离界面的梯度密度缓冲液；

6）以1300～1700r/min离心，将细胞分散在梯度密度缓冲液的不同密度区域，吸取B液下方和C液上方区域的细胞悬液，放入预先加入15～30ml 10vol% FBS-DMEM/F12的离心管中，轻柔混匀；

7）1000～1300r/min离心获得细胞团块，加入10～20ml 10vol% FBS-DMEM/F12，轻柔混匀，1000～1300r/min离心并收集细胞团块；

8）以10vol%FBS-DMEM/F12培养基重悬细胞团块，接种于培养瓶或培养皿中，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

6.根据权利要求3或5所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是所使用的人子宫内膜组织是以PBS清洗干净，并充分切碎的组织。

7.根据权利要求3或5所述的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其特征是将所述人子宫内膜组织以所述消化液消化不少于2次，合并消化得到的细胞悬液。

8.权利要求1所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞在制备预防或治疗缺血性疾病的药物中的应用。