[发明专利]一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法

说明书

本发明公开了一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法，属于细胞学和生物学领域，主要包括以下步骤：(1)以甜叶菊叶片为离体培养的外植体材料，将其接种到愈伤组织培养基；(2)产生绿色愈伤组织后，转入芽诱导培养基；(3)产生幼芽后，转入生根培养基，诱导产生大量根系后，按常规继代培养和扩繁，获得甜菊双糖苷SBIO含量高的株系。不同培养基中均加入半乳糖苷酶作为甜菊苷转化为甜菊双糖苷的水解酶，利用本发明提供的离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法，经过培养后甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量显著增加，培养过程简单、高效。

技术领域

本发明属于细胞生物学和生物领域，为一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法，具体涉及通过甜叶菊离体培养来提高甜叶菊叶片中甜菊双糖苷SBIO含量的方法。

背景技术

甜菊糖苷(steviol glycoside，SGs)是一类从甜叶菊(Stevia rebaudianaBertoni)叶子中提取得到的高甜度、低热值甜味剂，甜叶菊被誉为继甘蔗和甜菜之后的“第三糖源”。甜菊糖苷还具有药理活性，如降三高、抗肿瘤、抑菌、增溶、抗腹泻等特性，亦可作为合成其他功能性化合物的前体物质。甜菊糖苷的化学本质为四环二萜。甜菊糖国家标准(GB8270－2014)中列出含量最高的九种甜味成分，即甜菊苷(stevioside，Stv)，瑞鲍迪苷A-E(rebaudioside A、B、C、D和E)，杜克苷A(dulcoside A)，甜茶苷(rubusoside)和甜菊双糖苷(steviolbioside，sbio)。甜菊双糖苷分子式为C₃₂H₅₀O₁₃，分子量为642.73。

甜菊双糖苷与甜菊苷(ST)相比，其分子式中的19碳位上少一个葡糖基。甜菊双糖苷具有降血糖，抗结核等功效，也可以作为中间体进一步衍生成为其他生理活性更好的化合物，如甜菊双糖苷酯、甜菊双糖苷酰肼等对抗菌和抗结核具有疗效的化合物。但是，甜菊双糖苷在甜叶菊中的含量很低，而甜菊苷相对含量较高。已有研究报道，甜菊双糖苷可以通过甜菊苷的水解酶法，即β-半乳糖苷酶水解法获得。

已有研究表明，β-半乳糖苷酶可以选择性水解甜菊苷中碳19位糖酯键，从而获得甜菊双糖苷，而且在37.5℃，甜菊苷的底物浓度为25mg/mL，加入β-半乳糖苷酶量为12000U/g ST，12h时甜菊苷的转化率为99％以上。但这个方法，只能解决甜菊双糖苷提取的工艺问题，并不能长期解决甜叶菊中提高甜菊双糖苷含量的瓶颈问题。因此，我们考虑到采取离体培养基中加入水解酶的方法，或许能够间接地获得高甜菊双糖苷含量的甜叶菊植株。另外，考虑到甜叶菊从叶片脱分化形成大量愈伤组织的过程中细胞内的甜菊苷，通过吸收培养基中的水解酶，β-半乳糖苷酶，将愈伤组织细胞中的甜菊苷水解为甜菊双糖苷，并在细胞内储存，或重新分配在细胞组织中。但迄今为止，通过离体组织培养提高甜叶菊叶片甜菊双糖苷含量的研究未见报道。因此，我们尝试通过组织培养的方法，向各阶段培养基中添加外源β-半乳糖苷酶，希望获得叶片中甜菊双糖苷含量较高的甜叶菊株系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO的方法，属于细胞学和生物学领域，其能够快速获得甜菊双糖苷SBIO含量高的甜叶菊组培苗，以解决现有技术中存在的问题。

本发明提供一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法，其主要过程如下：

(1)以甜叶菊叶片为外植体接种到愈伤组织培养基；其培养基组成为：MS+20g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+600U/gβ-半乳糖苷酶；其组培室环境温度15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000Lux(优选为2000Lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼12h/夜12h)。