[发明专利]一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用。先将氧化石墨烯在含有氨基离子液体的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中进行剥离，制备离子液体功能化石墨烯；然后在上述分散液中制备类水滑石纳米片，制得离子液体功能化石墨烯‑类水滑石纳米片复合物，采用滴涂法制备该复合物修饰的玻碳电极，再将弧菌探针ssDNA通过生物连接剂固定在修饰电极表面，制备所述的弧菌DNA传感器。该DNA传感器具有良好的灵敏性和选择性、较低的检测限和较宽的线性范围。该制备方法包括：修饰电极材料的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器与目标DNA的杂交；传感器电化学信号检测。

技术领域：

本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体涉及一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法，以及用于高灵敏检测致病性副溶血性弧菌的特异性DNA。

背景技术：

海洋弧菌是一类活动力极强的棒状或弧状革兰氏阴性菌，广泛分布于半咸水、沿岸、河口、海洋水体、沉积物和海洋生物体内，分布在全球河口环境中的一种革兰氏阴性菌，当食用生的、未煮熟的或处理不当的海鲜时，会引起人类急性胃肠炎。其中以副溶血性弧菌的危害最大，研究发现副溶血性弧菌株中都发现了tlh 基因，因此它被认为是检测总副溶血性弧菌的一个有用的指标。近年来，DNA 电化学生物传感器以其成本低、灵敏度高、响应速度快、选择性好以及仪器小型化等优点引起了人们的广泛关注。迄今为止，各种类型的DNA电化学生物传感器以其广泛的纳米材料如类水滑石(LDH)、碳纳米管(CNTs)和石墨烯(GR) 等，被用于提高DNA生物传感器的灵敏度和稳定性，但用于检测弧菌的DNA 传感器在灵敏度和检测限方面仍然有很大提升空间。

石墨烯(GR)是一种sp²杂化碳原子组成的具有一个碳原子厚度的二维材料，于2004年由Geim首次成功制备，因其具备优良的机械性能和电性能，近年来引起了各个领域研究的广泛关注。化学还原是一种低成本的方法，因此被广泛应用于GR的大规模工业生产。然而在生产过程中，GR片层间会因强的π-π相互作用而发生不可逆的堆叠，这不仅损害了GR的分散性能，同时也增大了片层间的接触电阻，从而严重限制了GR的电化学性能以及其在各个领域内的应用。类水滑(简写为LDH)是一类二维纳米阴离子粘土，组成通式可表示为[M_1-x²⁺M_x³⁺(OH)₂]^x+(A^n-)_x/n·mH₂O，具有水滑石层状结构且片层携带正电荷，层间存在可交换的阴离子。类水滑石纳米片(LDHNS)是指其以单层或几层类水滑石纳米片形式存在，不仅具有原始LDH的各种性能，同时还呈现出开放的内表面、分子厚度的正电层、大的比表面积和丰富的活性位点等特点，因此极大扩展了LDH的应用领域。因此研究者将带正电荷的LDHNS与GR进行复合来阻止两种组分的聚集，提高复合物的导电性能。虽然复合的方案可以解决GR片堆叠和LDHNS聚集的问题，但复合后的杂化物容易沉降，整体分散性较差，而且作为电极修饰材料其导电性也需进一步提高。氨基功能化离子液体不仅是一种高导电性、具有特殊溶解性能的绿色溶剂，而且具有功能性的氨基，因此可能通过与 GO表面大量的环氧环发生开环反应，修饰到基于GO/GR复合材料表面。由于特殊的溶解性、大量的电荷以及高的导电性，离子液体的引入可以大大提高 GO/GR基材料的分散性、稳定性和导电性。

本发明先使用氨基功能化离子液体对GO进行剥离，再在甲酰胺介质中合成LDHNS，从而制备离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片(IL-GR-LDHNS)复合物，以此IL-GR-LDHNS复合膜修饰的玻碳电极为基础，建立了一种高灵敏的弧菌DNA杂交检测方法。IL-GR-LDHNS复合膜不仅能够有效地固定DNA，而且具有大的比表面积，丰富的活性位点，良好的生物相容性、导电性和分散性，有效地促进了电子转移。与其它报道的方法相比，该方法对目标DNA的检出限较低，线性范围宽，选择性好，可实现对弧菌特征DNA的高灵敏无标记检测。

发明内容：