[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术创制不包颈水稻两系不育系的方法

说明书

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9技术培育不包颈不育系水稻的方法，包括：根据水稻中EUI基因编码序列设计靶标序列，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9‑EUI‑gRNA重组载体；通过农杆菌转化水稻愈伤组织获得转基因苗；转基因苗经阳性筛选、测序分析、转基因元件检测，得到不含转基因成分的功能缺失突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术对EUI基因进行定点突变，实现定向创制既不带转基因成分又不包颈水稻不育系的方法，具有靶向效率高、育种周期短、成本低、实用性强等优势。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域,具体地说,涉及一种利用CRISPR/CAS9技术对水稻EUI基因定点突变的方法。

背景技术

杂交水稻的研究与应用为我国粮食安全、农民增收和种业发展做出了巨大的贡献。不断运用新技术、新方法将已克隆的功能基因转化为育种家所能利用的分子设计育种，以提高杂种优势、降低种子生产成本是杂交水稻研究的重要方向。目前生产上应用的水稻不育系抽穗时普遍存在不同程度的包颈现象，极大地制约不育系异交结实率和繁殖制种产量。虽然生产上可应用喷施赤霉素的方法能克服不育系的包穗现象，但赤霉素的使用提高种子生产成本，降低种子质量，且容易造成环境污染。因此，实现遗传解除不育系包穗障碍一直为育种家所追求的。

20世纪80年代初，由美国学者Rutger等发现并命名的高秆隐性突变体 eui(elongated uppermost Internode)基因为生产上解决不育系包颈遗传障碍创造了有利的条件。EUI是编码细胞色素氧化物类酶合成的一个基因，催化GA的分解代谢，在抽穗期的幼穗和最上节间表达强烈。EUI基因突变可导致编码合成的酶失活，使得突变体幼穗和最上节间中积累大量的GA，从而引起最上节间的剧烈伸长。由于这种上部节间显著伸长的特性可克服杂交水稻不育系稻穗不能完全伸出叶鞘的包穗障碍，同时也可使恢复系株高和穗颈节增高，有利于提高杂交水稻制种产量，故具有十分重要的育种价值。

自eui基因发现以来，水稻育种学家一直致力于将该基因应用于杂交水稻，用以解除不育系包颈障碍，减少制种时使用赤霉素所造成的环境污染，降低种子成本，提高制种产量。但由于技术条件的限制，在探索eui基因的育种应用过程中主要使用杂交、回交法和直接诱变法两种常规的育种方法。杂交、回交法是通过杂交和多次回交将高秆隐性突变体eui基因转移到优良杂交水稻不育系中，从而选育出吐颈的杂交稻不育系。如申宗坦等(1987)和何祖华等(1991)用籼型三系不育系珍籼97A转育的吐珍长A，王才林用两系光温敏培矮64S培育出的P8hS。直接诱变法是用γ-射线辐射或化学诱变剂处理生产上应用的三系杂交水稻保持系、两系杂交水稻不育系，从诱变后代中选育具有目标性状的吐颈不育系。如杨仁崔等用金23B辐射后经回交育成的金23eA，周广洽等用培矮64S 辐射育成的双低培eS。虽然这两种方法都能从遗传上克服不育系的包颈问题，但均存在很大的弊端。杂交、回交法由于难以完全保留原不育系综合的优良性状，且存在育种难度大、周期长、效率低弊端，至今尚无可接近生产应用的选育成果报道；而直接诱变法产生的变异缺乏定向性，且有益突变的频率极低(10 万分之1.5)，只有大规模种植诱变后代，才有选择到目标性状的机会，而大规模种植诱变群体必然会导致花费更多的人力和物力，给育种工作带来许多不便之处。因此，发明一种高效、快速、精确定向改良不育系包颈遗传障碍，且又能保持原不育系优良性状新技术，对于促进杂交水稻的发展具有重要意义。