[发明专利]免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒所述试剂盒包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品。本发明还公开一种免提取的检测CYP2C19基因多态性的检测方法。所述DNA聚合酶是本身或者经过基因工程改造后具有很强的抗PCR抑制剂的一种或几种DNA聚合酶。本发明的试剂盒及检测方法真正实现微量样本直接检测，免除外周血、拭子类样本的DNA提取环节。本发明中将微量的血液类样本、口腔拭子样本直接加入到PCR反应液中，运行PCR扩增程序即可完成CYP2C19基因多态性检测。整个检测过程不涉及有毒试剂，安全便捷，操作简易，整个检测耗时短，灵敏度高、特异性强、可以应用于高通量检测。

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测人基因组中是否存在CYP2C19基因多态性的免提取的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

人CYP2C19基因位于10号染色体上，长约90.21kb，含9个外显子和8个内含子。

研究发现，CYP2C19基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢，如奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑，泮托拉唑(质子泵抑制剂)；氯吡格雷(血小板聚集抑制剂)；安定，氯巴占，苯妥英钠，苯巴比妥等(抗癫痫药)；氟西汀，西酞普兰，艾司西酞普兰，阿米替林，氯米帕明，丙咪嗪等(抗抑郁药)；地西泮、唑吡旦(镇静、安眠药)；环磷酰胺(抗肿瘤药)；氯胍(抗疟疾药)；伏立康唑(抗真菌药)；孕黄体酮等(激素)；普萘洛尔(心率不齐心绞痛药物)等。CYP2C19基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。CYP2C19酶活性存在多态性，因此不同的个体对药物代谢能力不同，产生的药物毒副作用及治疗效果不同。

CYP2C19除了野生型等位基因CYP2C19*1外，存在CYP2C19*2～CYP2C19*21等多种突变等位基因，其中CYP2C19*2(外显子5的681位单个碱基突变G→A)和CYP2C19*3(外显子4的636位单个碱基突变G→A)为CYP2C19基因在亚洲人群中的主要突变类型，突变后造成相关药物代谢缓慢，CYP2C19*17为功能获得性等位基因，酶活性增强，代谢加快，在白种人以及美国黑人中的突变比例较高。CYP2C19*17有5′侧翼区-806C→T和-3402C→T 2个突变位点，其中-806C→T起效应作用，因为含-806C→T的调控元件可结合肝核蛋白，可加快CYP2C19的转录速率，从而提高CYP2C19对奥美拉唑等药物的代谢效率。CYP2C19*17纯合子个体对奥美拉唑代谢快，且CYP2C19*17和CYP2C19*1纯合子个体之间对奥美拉唑的药物代谢动力学差异极显著，使得CYP2C19*17成为个性化用药的靶点。

CYP2C19基因多态性的检测方法，主要是将待测样本经过核酸提取后再经PCR-RLFP法、直接测序法、固相/液相芯片法或ARMS-qPCR法进行检测。人基因组DNA提取方法，按照核酸释放原理可分为煮沸法、盐析法、碘化钾法、胍盐法等，按照核酸分离方式可以分为离心法、吸附法，按介质分有柱法和磁珠法。

以上这些提取方法均需要借助专业的提取设备和耗材、提取试剂，操作人员需要熟练掌握提取操作技能。单个样本提取需要耗时0.5-1小时，加上核酸检测环节，从样本入检到得到检测结果通常需要耗时2-3小时，具体检测时长受制于样本量和提取的自动化程度。整个提取过程步骤较多，操作繁琐，一旦提取出现误操作，会导致整个实验的失败，在提取过程中也容易造成样本之间交叉污染，以及提取设备的污染。而且提取后需要进行专门的消毒清洁工作。另外，提取过程中操作人员需要接触有毒或者有腐蚀性的化学试剂，提取中会产生大量的废液，对人体以及环境都不够友好。市面上也有一些免提取的试剂，但仍需要样本的前处理步骤，需要借助核酸释放剂处理10-30分钟，再经离心才能用于下一步检测，并未实现真正的样本直接检测。以上这些方法都有着通量的限制，不能满足实际应用的需求。目前尚没有不用提取核酸就可以直接以荧光定量PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。

发明内容