[发明专利]一种基于灰霉毒素倍半萜合酶BcBOT2基因的植物灰霉病分子检测方法

权利要求书

1.一种用于快速检测植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途径中关键酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特异性引物，其特征在于所述的引物对为正向引物BCbot2-F2和反向引物BCbot2-R2；

正向引物BCbot2-F2（5’ to3’）：GACTTCCATTTGGCTTCG；

反向引物BCbot2-R2 （5’ to3’）： TGTGCTAATACCCCGTCC。

2.权利要求1所述用于快速检测植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途径中关键酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特异性引物在用于植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）的快速检测中的应用。

3.一种采用权利要求1所述用于快速检测植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途径中关键酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特异性引物对植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea）进行检测的方法，其特征在于，提取待测样品的DNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）的方法对待检样品DNA进行特异性扩增，确认是否存在扩增产物；所述的待测样品为植物发病叶片、果实或真菌纯培养物。

4.权利要求3所述的检测方法， 其特征在于所述的通过PCR扩增的方法对灰葡萄孢霉（B. cinerea）的DNA进行特异性扩增，具体扩增体系总体积为25μL，包括2×taq MasterMix：12.5μL；引物BCbot2-F2：1μL；引物BCbot2-R2：1μL；ddH₂O：9.5μL和1μL DNA模板；其中2×taq Master Mix成分为：20 mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPs，余量为灭菌ddH₂O。

5.权利要求3所述的检测方法， 其特征在于；将配制好的反应液进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环后；72℃延伸10min；扩增反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件100V~110V，20min~30min，在337bp位置产生特异性条带作为结果判定，产生特异性条带表示检测结果为阳性，存在植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea），在337bp位置未存在特异性条带表示检测结果为阴性，不存在植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea）。