[发明专利]一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统

说明书

本发明公开了一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统，通过创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

技术领域

本发明涉及超分辨显微成像技术领域，特别涉及一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统。

背景技术

在生命科学技术飞速发展的今天，为了进一步了解和研究生命体之间的相互作用、疾病的产生机理，人们迫切需要获得更加精确的细胞内部的结构信息。但是，由于光学衍射极限的存在，常规的光学显微镜的分辨率只能达到200nm左右，难以满足现代生物医学的需要。近年来，单分子定位超分辨荧光显微技术的出现，如光敏定位显微术(PLM)、随机光学重建显微术(STORM)、荧光光敏定位显微技术(FPLM)等，它们克服了衍射极限，达到20nm的横向分辨率和100nm的轴向分辨率，有力地推动了生命科学的发展，广泛应用于生物医学的各个领域。虽然单分子定位超分辨成像系统能够实现超分辨成像,但是较低的轴向分辨率仍有待改善。为了克服这一问题，有研究人员在光路中加入柱面镜，将单分子定位显微的景深扩展到600nm；或者在探测光路中引入特殊相位，将点扩散函数变为双螺旋的形式，实现荧光分子在轴向±2μm范围内的三维定位；或者将探测光路分光并引入光程差，通过计算两路光的光程差来获得荧光分子的轴向位置，使成像景深达到1μm。虽然这些方法显著地提升了单分子定位超分辨成像系统的成像景深，但对于厚度约10μm的完整细胞而言，现有的方法还不能满足多分子追踪时的大景深要求。

为了获取整个细胞的信息，传统方法是对同一细胞的不同轴向位置的层面进行一系列扫描探测，再由相关算法将所有层面信息按照轴向位置排序合成，还原出整个细胞内的分子信息。但是，在三维扫描的过程中，不同层面的信息会相互影响，产生背景噪声和荧光漂白，降低分辨率。一些研究者提出使用变形光栅对样品进行多层面探测，但由于变形光栅的能量主要分布在衍射的0级与±1级，故该方法最多只能对细胞内九个不同层面同时成像，因此，在实现大的轴向探测范围的同时无法保持较高的轴向分辨率。

因而现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统，可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种单分子定位显微成像方法，其包括如下步骤：

创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；

多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块的步骤包括：

对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅；