[发明专利]一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基

说明书

本发明公开了一种用于裸质粒pSFVK1‑NMM生产的大肠杆菌发酵培养基。发酵培养基包括：种子液培养基、发酵基础培养基、发酵补料培养基和微量营养液。每1升种子液培养基含有：胰蛋白胨5‑7g、酵母提取物10‑14g、甘油4‑6g、Na₂HPO₄ 10‑11g、KH₂PO₄ 2‑3g；每1升发酵基础培养基含有：胰蛋白胨10‑14g、酵母提取物22‑26g、甘油8‑12g、Na₂HPO₄ 5‑6g、KH₂PO₄ 1‑1.5g、MgSO₄溶液:1‑3ml；每1升发酵补料培养基含有：葡萄糖160‑200g；每100mL微量营养液含有：MgSO₄ 2.5g、Nacl 10g、L‑谷氨酰胺5g、甘氨酸2g、NaH₂PO₄ 5g。利用工程菌XL10‑Gold/pNMM和该培养基，通过控制发酵培养条件，可以获得质粒高特异性产率，实现NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1‑NMM的发酵生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基及培养方法。

背景技术

质粒是一类双链环状DNA分子，携带染色体以外的遗传信息。由于质粒具有自我复制功能，一个细胞可含有多个拷贝的质粒。过去的数十年中，质粒已经成为遗传学、分子生物学等领域最重要的工具，尤其是近些年来，更成为基因治疗和基因疫苗等医药领域必不可少的工具。质粒可用于治疗单基因缺陷类疾病，例如囊泡性纤维症、肌肉萎缩症、血友病等，也可用于诱导针对肝炎等感染性疾病甚至肿瘤的特异性免疫应答。

质粒DNA疫苗是从上世纪90年代开始研究的一种新型疫苗，到现在已经发展将近30年，具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点，和以病毒为基础的疫苗相比，其具有独特的优势。至今已经有4种兽用的DNA疫苗已经上市销售，还有45种预防或治疗人类疾病的DNA疫苗分别进入了I，II和III期临床试验。随着DNA疫苗和基因治疗的发展，对于质粒DNA的需求将会增大，急需发展简便、省时、高产的质粒DNA生产工艺。

质粒DNA疫苗的研究、开发和生产基本涉及上游、中游和下游三个阶段，上游包括载体，基因重组质粒构建，宿主菌和工程菌种子库。中游主要是细菌发酵。下游的重点是质粒DNA的分离和纯化。NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM分子量较大，达到15K左右，对于宿主菌来说是一种沉重的负担。在宿主菌的生长过程中，极易造成质粒DNA的不稳定，从而影响单个细菌中质粒的拷贝数。优化宿主工程菌发酵培养的参数和条件主要目的是为了提高产量，使从每升培养基中获得尽可能多的菌体，再从每克菌体中提取到尽可能多的质粒DNA。想要得到较高的产量一般要经过优化培养基的成分和特殊的发酵(溶氧反馈型补料发酵)策略来实现。目前有较多关于重组蛋白发酵条件优化的研究报道,而质粒DNA发酵条件与重组蛋白发酵条件不一样，针对质粒DNA发酵培养基和培养条件的设计优化又非常少，在这种情况下，建立一种对质粒发酵培养进行优化的科学合理的方法是非常必要的。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌发酵培养基，用于NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM的生产

本发明目的还在于提供生产NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM的工程菌种子库构建方法及种子库产品。用于生产NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM的工程菌，是转化有质粒pSFVK1-NMM的大肠杆菌XL10-Gold，命名为XL10-Gold/pNMM。

本发明的目的还在于提供基于上述大肠杆菌发酵培养基的高密度发酵方法。该方法利用上述工程菌及发酵培养基，并控制发酵培养条件，从而获得高特异性产率的工程XL10-Gold/pNMM。

一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基，