[发明专利]一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法

说明书

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

技术领域

本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种H7亚型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR的检测方法，包括鉴定H7亚型流感病毒的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)，该类病毒可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。近年来时有H7亚型流感病毒爆发，如1999～2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失。2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅造成了重大的经济损失，而且感染89人。自2013年2月以来，我国华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。

近年来，在我国还出现了致死禽类的高致病性H7N9禽流感病毒。这些事件表明H7亚型禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在的威胁。

发明内容

本发明的目的是提供一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测H7亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对H7forward、H7reverse和探针H7probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物序列H7forward：

5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物序列H7reverse：

5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:2)

探针序列H7probe：

5′-CCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTA-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

本发明再一个方面提供检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL H7forward、H7reverse和H7probe各0.5μL，RNase Free dH₂O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL。

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增