[发明专利]一种改进的人源模拟Bt Cry毒素蛋白功能效应物(GGCC)及其设计方法与应用

说明书

本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法和应用，属于基因工程和生物防治领域。本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白GGCC_scFv，所述人源分子改造杀虫蛋白GGCC_scFv的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述杀虫蛋白GGCC_scFv与小菜蛾(Plutella xylostella)中肠BBMV的亲和力比Cry1Ab、Cry1B毒素高，且与Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1B毒素竞争结合小菜蛾中肠BBMV，为Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1B毒素的模拟物；经小菜蛾室内杀虫生物活性测定，3d致死率可达50％，7d致死率可达95％，可有效的替代Cry1A类毒素用于生物防治虫害。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体涉及一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种昆虫病原菌，其主要杀虫活性物质为细胞内毒素伴胞晶体蛋白，对多种农业害虫具有特异性毒杀作用(Bravo andSoberon，2008)；Cry1Ac是Bt毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标受体主要包括中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles，BBMV)上的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、氨肽酶(aminopeptidase N，APN)和钙粘蛋白(cadherin)。ALP作为Cry1A毒素的受体，可促进毒素对膜的插入和孔道形成。诸多从双翅目和鳞翅目昆虫物种中分离出的ALP已被鉴定为Cry1Ac毒素的受体。抗Cry1Ac毒素独特型单链抗体(Anti-idiotype antibody scFvs，Anti-Id scFvs)，可以模拟Cry1Ac毒素的结构与功能。

Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险(Bravo and Soberon，2008；Pigott et al，2008)，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发，Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry1Ab毒素并与其竞争受体蛋白，已成为目前国内外科研的重点，专利号为ZL201410037000.9的中国专利公开了一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12(以下简称B12)，其能模拟Bt毒素并用作生物农药防治虫害，取得了积极的效果，但是该抗体的可溶性表达蛋白丧失了与昆虫BBMV结合能力，杀虫效果不甚理想。

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段。将不同来源的基因按预先设计的蓝图，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，在体外构建重组DNA分子，然后导入活细胞，产生出人类所需要的基因产物。如DeMaagd于2002年针对Cry1Ab毒素在替换上Cry1C毒素的domain III后，对甜菜夜蛾的毒性较Cry1C提高了近10倍。

随着对抗体结构与功能关系的认知不断加深，借助计算机模拟技术进行抗体改造可以在限定范围内有目的地进行设计，根据抗体-抗原结合的氨基酸位点分析进行设计与定向改造，Wong等(1995)在已知抗原-抗体复合物三维结构的基础上，对抗苯偶氮基胂酸酯(anti-p-azophenylarsonate)Fab重链108位上的Phe定点突变为Trp之后，相对野生抗体而言，突变体亲和力就提高了10倍；为进一步对抗体分子结合区域改造指明了方向，但目前结合链替换分子改造方法来提高抗Bt毒素抗独特型单链抗体亲和力的方法并通过Octet技术平台筛选的方法尚未见报道。

发明内容