[发明专利]一种针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂的制备方法

说明书

本发明涉及抗生素降解技术领域，尤其涉及一种针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂的制备方法，包括二甲基异咯嗪的合成、一次纯化、二次纯化、小球藻蛋白液的提取、蛋白液的纯化、试剂的复配。本发明以光色素二甲基异咯嗪为磺胺类抗生素检测探针，可高效定位磺胺类抗生素，提高针对磺胺类抗生素特异性降解的效率，同时试剂释放的小球藻蛋白液可有效针对磺胺类抗生素的苯环结构进行断裂，将磺胺类抗生素降解为醛、醇等物质，从而针对性的对其完成降解消除。

技术领域

本发明涉及抗生素降解技术领域，尤其涉及一种针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂的制备方法。

背景技术

磺胺类抗生素是上世纪30年代发现的具有对氨基苯磺酰胺结构、能有效防治全身性细菌性感染的一类化学药物，对大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌都有抑制作用。在中国，磺胺类抗生素年产量约2.5万吨。磺胺类抗生素具有疗效良好，使用方便、性质稳定、价格低廉等优点，在水产养殖的疾病控制中起着不可替代的作用。但是同样由于其广泛使用造成磺胺类抗生素的对海水养殖生态环境造成破坏，磺胺类抗生素的有效去除成为亟待解决的难题。

磺胺类抗生素的去除技术有物理、化学和生物三大类技术。物理法由于成本高，去除不彻底，化学方法易对生态造成破坏，同时易产生二次污染，生物方法相比与前两者，环境友好且成本低，已经在水产养殖废水处理中得到广泛应用。生物方法中起关键作用的主要是微生物降解。已发表的微生物处理磺胺类抗生素的相关资料表明，由于磺胺类抗生素具有复杂的结构，故其降解率普遍不高，且已相关微生物在针对磺胺类抗生素的降解时也有一定的局限性，即多数情况下，一种微生物只能特定降解一种磺胺类抗生素。

发明内容

本发明为了克服磺胺类抗生素解率低、具有局限性的问题，提供了一种简单易行，安全环保的针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂的制备方法，采用该方法制得的针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂具有磺胺类抗生素导向性与特异降解性，同时兼具低毒、环保、稳定、作用条件温和、污染物降解彻底的优点，且对环境无二次污染。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对磺胺类抗生素特异性降解的试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)二甲基异咯嗪的合成：将1.0～1.2g干燥的6，7二甲基-9-甲酸基甲基异咯嗪固体置于烧杯内，加入30～32mL 0.10～0.12M的硼酸溶液和130～135mL 0.1～0.12M的氢氧化钠溶液，避光搅拌反应90～100min，得二甲基异咯嗪反应液；在避光、碱性条件下，将6，7二甲基-9-甲酸基甲基异咯嗪(FMF)脱去乙醛基制备得到二甲基异咯嗪，制备方法较为温和，反应过程易控，工艺简单；

(2)二甲基异咯嗪的一次纯化：过滤二甲基异咯嗪反应液，将滤液中加入萃取剂萃取，反复萃取直至萃取液为无色；在38～40℃温度下用旋转蒸发仪对萃取液旋转蒸发进行浓缩，浓缩液终体积为18～20mL；

(3)二甲基异咯嗪的二次纯化：对浓缩液做薄层层析分离，薄层厚度为0.18～0.25mm，通过凝胶成像仪观察荧光，再用柱层析分离浓缩液，层析后得到二甲基异咯嗪的溶液，在70～74℃旋转蒸发，得到浓缩液，再置于真空干燥箱内以55～58℃干燥得到浅黄色二甲基异咯嗪固体粉末；薄层层析适用于微量、挥发性较小、不耐温的物质分离，根据二甲基异咯嗪与杂质在固定相和流动相中分配系数不同进行柱层析分离，经过两次分离纯化后二甲基异咯嗪的含量得到大大的提高；

(4)小球藻蛋白液的提取：将小球藻在2～4℃、6000～8000r/min条件下离心浓缩8～10min，将浓缩液于超声破碎仪中进行细胞破壁，破碎后所得液体置于2～4℃、10000～13000r/min条件下离心15～20min，取上清液，即为粗蛋白液；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于小球藻蛋白的提取与纯化；