[发明专利]一种淋巴细跑EB病毒核酸荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种淋巴细跑EB病毒核酸荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：取待检验组织组织，经过裂解、离心，将混合液体上层水相转移至一干净离心管中，加等体积异丙醇，混至均匀后，离心取管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；加入无RNA酶的去离子水，即获得的RNA溶液；取RNA溶液，加入逆转录buffer、上下游引物、DEPC水、逆转录酶，得到的逆转录终溶液即为DNA溶液；将各反应管放入荧光定量PCR仪器中，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型，按下列条件进行扩增。有益效果：样本在聚合酶的作用下对靶区域进行扩增，利用荧光探针技术实时监测扩增产物的累积；对扩增产物的检测判断EB病毒核酸的存在；具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，具体涉及一种淋巴细跑EB病毒核酸荧光定量PCR检测方法。

背景技术

EB病毒仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。被病毒感染的细胞具有EBv的基因组，并可产生各种抗原，已确定的有：EBv核抗原，早期抗原(ea)，膜抗原(ma)，衣壳抗原(vca)，淋巴细胞识别膜抗原(lydma)。

EB病毒长期潜伏在淋巴细胞内，以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合在染色体内。EB病毒在人群中广泛感染，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。青年期发生原发感染，约有50％出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播，也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。人体感染EB后能诱生抗EBna抗体，抗ea抗体，抗vca抗体及抗ma抗体。已证明抗ma抗原的抗体能中和EBv。上述体液免疫系统能阻止外源性病毒感染，却不能消灭病毒的潜伏感染。

目前ELISA检测EB各项抗体是临床诊断EB感染的重要指标之一，但它实际上检测的是人体对EB感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法准确灵敏地反映EB感染的情况。由于鼻咽癌外周血循环的游离EB-DNA的拷贝数随着全身化疗周期的进行而呈现动态变化，所以检测鼻咽癌患者EB-DNA的表达水平对判断病灶残留、复发、转移、判断治疗的敏感性、综合治疗方案的及时更改、确认以及判断疗效、预后均具有重要的指导意义，EBV目前已经成为鼻咽癌诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项参考依据。基于EB感染情况如此严重，开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种淋巴细跑EB病毒核酸荧光定量PCR检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种淋巴细跑EB病毒核酸荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤一、样品RNA的抽提

(1)预处理待检验组织

取待检验组织组织，加入1ml～10ml的TRIZOL试剂进行裂解，获得裂解样品，取1ml裂解样品加入0.2ml～0.5ml的氯仿，手动剧烈振荡管体10S～15S后，置于15℃～30℃孵育2～3min，然后将液体置于离心机，在0℃～4℃的环境下，8000～12000rpm离心10min～15min；

(2)孵育待检验组织，获得含RNA的胶状沉淀块

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相、中间层、上层无色水相，检验组织的RNA全部被分配于水相中，将水相上层转移至一干净离心管中，加等体积异丙醇，混至均匀后，在15℃～30℃环境下，孵育10min～15min，然后将液体置于离心机，在0℃～4℃的环境下，8000～12000rpm离心10min～15min，取管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；

(3)制备RNA固体沉淀物