[发明专利]一种提高菘蓝花培效率的分化培养基及其制备流程

权利要求书

1.一种提高菘蓝花培效率的分化培养基及其制备流程，其特征在于，分化培养基以1L计，组成为：

大量元素：KNO₃ 1730~2050mg，NaH₂PO₄·H₂O 420~480mg，(NH₄)₂SO₄ 133~154mg，MgSO₄·7H₂O 495~515mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 300~340mg；

微量元素：MnSO₄·4H₂O 10~14mg，ZnSO₄·7H₂O 2.5~3.5mg，H₃BO₃ 5~7mg，KI 0.6~0.8mg，CuSO₄·5H₂O 0.022~0.026mg，CoCl₂·6H₂O 0.022~0.026mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.21~0.24mg；

铁盐：FeSO₄·7H₂O 25~29mg，Na₂-EDTA 34~38mg；

有机成分：肌醇47~56mg，D-蛋氨酸3~5 mg，甘氨酸3~5mg，L-天门冬酰胺19~25mg，盐酸硫胺素0.1~0.3mg，盐酸吡哆醇 0.4~0.6mg，生物素1.2 ~1.8mg，烟酸0.33~0.41mg，泛酸0.45~0.50mg；

天然活性物质：胡萝卜提取液60~65mL，生姜汁12~18mL；

无机物：N-甲基-N-亚硝基脲1.4~1.6 mg，AgNO₃ 6~9 mg，硅藻土0.2~0.5g；

碳源：蔗糖17~24g，麦芽糖9~12g；

凝固剂：植物凝胶2~4g；

植物激素：四甲基戊二酸 0.8~1.1mg，苯肽胺酸钠 0.3~0.5mg，KT-30 0.2~0.4mg；

余量为蒸馏水；

该分化培养基的制备流程包括以下步骤：

（1）制备母液

大量元素制备成20倍的母液；微量元素制备成200倍的母液，其中Na₂MoO₄·2H₂O先用蒸馏水单独溶解，再倒入其他微量元素母液中；铁盐制备成200倍的母液，FeSO₄·7H₂O 和Na₂-EDTA先分别加热搅拌溶解，然后将两种溶液混合；肌醇单独制备成100倍母液，其它有机成分制备成200倍母液；四甲基戊二酸和苯肽胺酸钠称量好后直接用蒸馏水定容，KT-30先用少量无水乙醇预溶，然后再用蒸馏水定容，三种植物激素均制备成质量浓度为0.1mg/mL的母液；以上各种母液制备完后分别用玻璃瓶贮存，铁盐母液需用棕色玻璃瓶装，所用母液均置于0~4℃冷藏保存备用；

（2）制备天然活性物质

胡萝卜提取液的制备：将胡萝卜洗净后切成小块，加水煮沸20min后冷却，包于纱布内挤压出汁液，沉淀后取上清液，置于0~4℃冷藏保存备用；

生姜汁的提取：将生姜块洗净后先放在冰箱中冷藏30min，再将生姜切成小块研磨成泥状，包于纱布内挤压出汁液，稍静置后过滤至密封容器中，0~4℃冷藏保存备用；

（3）配制混合培养液

先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐、肌醇、其他有机成分的母液加入烧杯中，再量取KT-30和苯肽胺酸钠的母液、胡萝卜提取液和生姜汁加入烧杯中，再将称量好的N-甲基-N-亚硝基脲、AgNO₃硅藻土加入烧杯中，搅拌溶解；

（4）溶解凝固剂和碳源

用天平称取所需的植物凝胶、蔗糖、麦芽糖放入烧杯中，再加入适量的蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状，然后再将上述配好的混合培养液加入到煮沸的植物凝胶中，最后加蒸馏水定容至1 L，搅拌均匀；

（5）调节pH

用滴管吸取物质的量浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入制备好的培养基中，边滴边搅拌，并随时用酸度计测培养基的pH，调节培养基的pH为5.6~6.0；

（6）培养基分装与高压蒸汽灭菌

待制备好的培养基稍微冷却后，按照40ml /瓶将培养基分装入100ml三角瓶中，塞上胶塞，包上锡箔纸，然后将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃取出，置于超净工作台中；

（7）培养基内添加四甲基戊二酸

按照40ml /瓶培养基的用量计算需加入的四甲基戊二酸母液用量，无菌操作下加入已灭菌的四甲基戊二酸母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。