[发明专利]一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用。该方法包括括将第一核酸片段和第二核酸片段于混合酶反应体系中进行所述连接，混合酶反应体系包括DNA连接酶和RNA连接酶，第一核酸片段为双链DNA。本发明还公开了一种测序文库的构建方法及其应用。本发明提供的核酸片段的连接方法，连接效率可达到85％以上，利用此连接方法进行测序文库的构建，有效文库的得率显著提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

随着测序技术的发展，测序文库运用越来广泛。在基因工程技术中，常需要将两个或两个以上的核酸片段链接，例如在DNA分子上连接接头，接头一般为一段短的平末端或粘性末端的人工合成核苷酸片段。接头和核苷酸的连接效率直接影响测序文库构建的质量。

发明内容

本发明提供了一种操作简便、连接效率高的核酸片段的连接方法，本发明还提供了一种测序文库的构建方法及其在测序中的应用。

本发明一方面提供了一种核酸片段的连接方法，包括将第一核酸片段和第二核酸片段于混合酶反应体系中进行所述连接，所述混合酶反应体系包括DNA连接酶和RNA连接酶，所述第一核酸片段为双链DNA。

在一个实施方式中，所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶；和/或

所述DNA连接酶为可催化粘端或平端双链DNA的连接，例如T4 DNA连接酶和/或Blunt/TA连接酶。

在一个实施方式中，第一核酸片段为磷酸化处理后的核酸片段。

在一个实施方式中，利用多核苷酸激酶进行所述磷酸化处理。

在一个实施方式中，所述多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述混合酶反应体系还包括多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述的第二核酸片段为双链核酸片段。

在一个实施方式中，所述的第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶8～20。

在一个实施方式中，所述的第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶10。

在一个实施方式中，所述的RNA连接酶在连接反应体系中的终浓度为0.15U/μL～1U/μL；和/或

所述的多核苷酸激酶在磷酸化处理体系中的终浓度为0.3U/μL～1UμL。

本发明另一方面提供了一种测序文库的构建方法，包括利用上述的连接方法获得连接产物，以得到所述测序文库，所述第一核酸片段来自待测样本。

本发明第三方面提供了一种测序文库，利用上述的构建方法获得。

本发明第四方面提供了一种测序方法，包括将上述测序文库进行测序。

本发明第五方面提供了一种用试剂盒，所述的试剂盒以实现上述方法。

有益效果：

RNA连接酶是用于RNA连接的一种酶，本发明提供了一种核酸片段的连接方法，在反应体系中同时包含DNA连接酶和RNA连接酶，出乎意料的，DNA的连接效率得到显著提高。实验结果表明，在无RNA连接酶的的连接条件下，采用DNA连接酶(DNA Ligase)将双链DNA片段进行连接反应，连接效率只有38.14％～77.5％。；而加入了常用于RNA和RNA 之间的连接的RNA连接酶(RNA Ligase)，使得DNA片段的连接效率达到85％以上。利用此连接方法构建测序文库，有效文库的得率显著提高。

附图说明