[发明专利]一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法

说明书

本发明专利涉及到用生物工程方法制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，属于生物工程范畴，具体涉及食蟹猴白细胞介素17A的提取纯化方法。该方法使用金属离子Ni²⁺亲和层析制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，在PH4.5±0.2的条件下上样和洗脱，产品纯度可达到95％以上，并且具有生物活性。

技术领域

本发明专利涉及用生物工程方法制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，属于生物工程范畴，具体涉及食蟹猴白细胞介素17A的提取纯化方法。

背景技术

亲和层析(affinity chromatography graphy,AC)是蛋白纯化的一种重要的方法，具有很高的选择性、分离性能以及较高的载量，它通常只需要一步处理即可将某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，是分离纯化蛋白质的有力工具。亲和层析技术是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即蛋白质可与另一种称作配体的大分子能发生特异的可逆结合。所谓的配体是指能被蛋白质所识别并与之结合的原子、原子团或分子。亲和层析的基本原理是：把待纯化的某种蛋白质的特异配体，通过化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基。载体的性能方面允许蛋白质自由通过，当含有目的蛋白的混合样品加到该配基上时，目的蛋白即和其特异性配体结合而吸附在配体载体的表面，而其他杂质则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可通过改变缓冲液的条件使之解吸附，并进一步收集(沈同，王镜岩.生物化学第二版[M]1990,223)。

食蟹猴白细胞介素17A的氨基酸序列含有六个半胱氨酸，生物体内形成含有链间二硫键均一的二倍体。食蟹猴白细胞介素17A在大肠杆菌中通常以包涵体的形式表达，该包涵体纯化很困难，经溶解、变复性后，目前常规方法采用金属离子Ni²⁺亲和层析在层析柱平衡至PH 7-8上样和洗脱复性液，使用10～15CV平衡液PBS，20-40mM咪唑，pH 7.4平衡，在上样液中加入咪唑，上样，再用平衡液PBS，40mM咪唑，pH 7.4平衡到紫外吸收值280几乎不变，用洗脱液PBS，500mM咪唑，pH 7.4洗脱，收集洗脱峰。食蟹猴白细胞介素17A在该方法中的溶解性和稳定性都较差，目标蛋白损失较大，并且该方法很难纯化出高纯度蛋白。本发明针对现有技术的不足，提供了一种制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A的方法。与现有技术相比，该方法纯化的蛋白与层析柱吸附效果好，纯化后的目标蛋白纯度明显提高，并且没有破坏食蟹猴白细胞介素17A的生物活性，可以作为ELISA或生物活性测定的标准品，具有广泛的应用前景。

发明内容

本申请的发明人经过大量研究，发明了一种食蟹猴白细胞介素17A的亲和层析洗脱方法。具体的：

本发明提供了一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法，该方法采用金属离子Ni²⁺亲和层析纯化带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A，用PH4.5±0.2的平衡液平衡层析柱，加入上样液，洗脱得到纯化的目标蛋白。

作为进一步优选的方案，平衡液PH为4.5。

作为进一步优选的方案，所述平衡液包含柠檬酸。

作为进一步优选的方案，所述平衡液组成为柠檬酸，NaCl和咪唑。

作为进一步优选的方案，所述平衡液组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，20mM咪唑。

作为进一步优选的方案，采用PH4.5±0.2的洗脱液洗脱得到纯化的目标蛋白；优选的，采用PH4.5的洗脱液洗脱得到纯化的目标蛋白。

作为进一步优选的方案，所述洗脱液组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，500mM咪唑。

作为进一步优选的方案，所述上样液中含有咪唑，所述咪唑浓度为20mM～25mM；优选的，咪唑浓度为20mM。