[发明专利]3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过提取灰树花子实体总RNA，逆转录合成cDNA，并通过克隆技术获得了灰树花的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，得到了3579bp的完整基因序列。经功能性实验验证该3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶不仅可显著提高灰树花中的三萜含量，且还能提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，涉及一种在灰树花中表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用。

背景技术

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase)，简称 HMGR，在甲羟戊酸(MVA)途径中催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羧戊酸，由于该过程不可逆，故该酶被视作MVA途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点。

药理研究表明，三萜类化合物是极具开发潜力的天然资源，萜类化合物广泛存在于高等动、植物及真核生物体内。它在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均有重要作用。研究发现，三萜类化合物具有多种生物活性，包括调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶作为早期酶类，它决定“碳流”的流向。Schaller等将橡胶树HMGR基因转入烟草，并对该转基因烟草进行研究，结果发现其形态未发生变化，但HMGR的活性增加了4-8倍，且甾醇含量增加了6倍。

灰树花，又称舞茸，是食、药兼用蕈菌，其属于非褶菌目、多孔菌科、树花属，含有多种功能性成分，如多糖、萜类、氨基酸等，具有良好的抗癌、抗病毒功能，因此被誉为“真菌之王，抗癌奇葩”。现有技术中已从灰树花中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，如中国专利申请（CN105132389，20151209）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，该3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶不仅可显著提高灰树花中的三萜含量，且还能提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量。

本发明提供了一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种编码所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种包含所述的基因的重组表达载体，含有SEQ ID NO.2所示碱基序列；

所述重组载体的原始载体为pET32a(+)或pBI121。

本发明还提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，农杆菌细胞、灰树花或樟芝菌丝体细胞。

本发明还提供了一种所述的重组宿主细胞在生产樟芝三萜或灰树花中三萜类化合物中的应用。

本发明通过提取一株高表达三萜的灰树花子实体总RNA，逆转录后构建cDNA文库，二代测序数据分析发现了一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，通过RT-PCR技术克隆了灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，得到了3579bp的完整基因序列；构建了真核表达载体pBI121-HMGR分别转化灰树花和樟芝菌丝体表达系统，对克隆的HMGR基因功能进行了验证。实验结果表明HMGR基因能够在灰树花及樟芝菌丝体中正常表达；且灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)可显著提高灰树花中的三萜类物质含量，此外，该基因还能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量，且其提高樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的能力优于现有技术中已分离获得的灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因。

附图说明