[发明专利]一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法

说明书

本发明涉及一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法，将外源基因(不仅限于抗原基因)整合入单增李斯特菌，不引入任何抗生素耐药基因，同时完整敲除细菌actA、plcB毒力基因，所制备的减毒重组单增李斯特菌可诱导高水平的细胞免疫应答，可对单增李斯特菌载体疫苗的制备提供可靠的技术方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法。

背景技术

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)由于具有独特的能在感染的宿主吞噬细胞浆内生长的生物学特性，成为了良好的T细胞免疫活化佐剂，已在疫苗制备上得到了广泛应用，部分以Lm为载体的重组活菌治疗性肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。如Wood LM et al.报道构建的两种基因重组Lm活菌疫苗(Lm-LLO-CD105A和Lm-LLO-CD105B)能显著减小乳腺癌小鼠动物模型的原发性和转移性肿瘤组织体积、降低乳腺癌自发小鼠模型肿瘤发生率(Wood LM,Pan ZK,Guirnalda P,et al.Targeting tumorvasculature with novel Lmsteria-based vaccines directed against CD105.CancerImmunol Immunother.2011,60(7): 931-942)。此外，还有一些以单增李斯特菌为背景的疫苗已经进入临床试验如PSA，Her2等 (Wood,Laurence M.,and Yvonne Paterson.2014.“Attenuated Listeria Monocytogenes:A Powerful and Versatile Vector for theFuture of Tumor Immunotherapy.”Frontiers in Cellular and InfectionMicrobiology 4:51–51.)。

但是上述重组Lm菌携带的外源基因是以质粒的方式引入，没有整合进细菌基因组，所以目标基因的表达不稳定，有可能随着质粒丢失而失去，并且质粒的引入还带入了其他非肿瘤抗原相关基因，尤其是上述质粒引入了氯霉素抗性基因，给细菌耐药的传播造成了威胁。由于Lm可对人致病，故作为疫苗载体的Lm需经严格地敲除致病相关基因进行减毒，而现有的作为疫苗载体的Lm菌株的减毒方式不明确，有的仅部分敲除毒力基因，存在毒力返祖可能。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称Lm)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

优选的，所述外源基因的上游带HindⅢ酶切位点、下游带XhoⅠ酶切位点。

上述一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带外源基因而得。

优选的，具体步骤如下：

(1)将拟整合的外源基因插入质粒pCW203(专利CN103074361B)的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒；

(2)切下步骤(1)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到打靶质粒，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(2)得到的打靶质粒电转化重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到目标菌。