[发明专利]重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用

权利要求书

1.重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用，其特征在于，所述重组减毒李斯特菌为重组减毒单增李斯特菌和重组减毒绵羊李斯特菌，两者分别以减毒单增李斯特菌和减毒绵羊李斯特菌作为载体，携带间皮素基因而得；

所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；

所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；

重组减毒单增李斯特菌的制备方法如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；

步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得；其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站，然后选择单增李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI 3900-Thermo Fisher Scientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，如SEQ ID NO.1所示；

步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建；切下中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-Meso；其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；

重组质粒pCW180的制备方法如下：

(2-A)将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；

(2-B)将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因插入上述步骤(2-A)得到的第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQ ID NO.5所示；

(2-C)用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-B)得到的第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180；

步骤(3)的具体方法是：将LmΔactAplcB-lacZ利用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；

步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；

步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证；

重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞LiΔact/plcB-lacZ；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；

步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得；其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站，然后选择绵羊李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI 3900-Thermo Fisher Scientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，如SEQ ID NO.1所示；

步骤(2)的具体方法是：

用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建；切下中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW154-Meso，如SEQ ID NO.13所示；

步骤(3)的具体方法是：将LiΔactAplcB-lacZ利用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；

步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；

步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证；

所述疫苗的给药方式为首次注射和至少两次加强注射，重组减毒单增李斯特菌与重组减毒绵羊李斯特菌依次交替注射。