[发明专利]基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗

权利要求书

1.基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，其有效成分为携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因的重组减毒单增李斯特菌；

所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；

所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因而得；具体步骤如下：

（1）合成HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因片段；

（2）构建打靶质粒；

（3）制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；

（4）利用步骤（2）制备的打靶质粒对步骤（3）制备的感受态细胞进行电转化；

（5）LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；

所述步骤（1）的具体方法是：从NCBI上查询HPV 16型E6蛋白和E7蛋白氨基酸序列，再通过软件，从中筛选出优势T细胞抗原表位依次排列，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得，共866bp，如SEQ ID NO. 1所示；

所述步骤（2）的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤（1）获得的融合抗原表位肽基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化等技术将融合抗原表位肽基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-E6E7，如SEQ ID NO. 2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建；切下中间质粒pCW203-E6E7的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamH I酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-E6E7，如SEQ IDNO. 3所示；其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.13所示；

所述步骤（3）的具体方法是：将LmΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀=0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀=0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可；

LmΔactAplcB-lacZ的制备方法如下：

（3-A）将上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段插入第二中间重组质粒pCW170的Not I酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒pCW190的基因序列为序列表中SEQ ID NO.6所示；

（3-B）将步骤（3-A）所得打靶质粒pCW190电转化Lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述步骤（4）的具体方法是：取打靶质粒电转至LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述步骤（5）的具体方法是：将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在 42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。