[发明专利]一种建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用

说明书

本发明公开了一种建立miR‑32‑5p基因敲除小鼠模型的方法及应用。将miR‑32‑5p的三个sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录后，注射到受精卵中，获得miR‑32‑5p基因敲除小鼠。miR‑32‑5p敲除小鼠具有抗炎性疼痛、抗抑郁和抗血管钙化能力。本发明首次使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，建立miR‑32‑5p敲除的小鼠动物模型，为研究miR‑32‑5p在神经系统及血管病变进程中的作用提供可靠、稳定的动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用。

背景技术

小鼠miR-32-5p基因在4号染色体反链上，全长70bp，是一种非编码单链RNA分子。神经系统病变方面：有研究报道，大鼠脊柱神经结扎后，脊髓背角中miR-32-5p表达水平增高。但同时在髓鞘内注射包含anti-miR-32-5p的腺病毒，使miR-32-5p表达水平降低后，由脊柱神经结扎导致的机械触摸痛、热痛觉过敏等神经性疼痛现象得到一定程度的缓解。血管病变方面：我们前期研究表明，在血管平滑肌细胞中，miR-32-5p可以靶向抑制磷酸酶-张力蛋白基因PTEN的表达，进而激活PI3K-Akt通路，使Runx 2蛋白活化，最终促进血管平滑肌细胞的钙化；miR-32-5p在冠心病合并主动脉钙化的患者血浆中的表达水平明显高于单纯冠心病患者。由此可见，miR-32-5p在神经系统及血管病变进程中扮演着重要角色，建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型可为更好地研究相关疾病提供可靠、稳定的动物模型。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的问题，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建一种miR-32-5p基因敲除小鼠动物模型。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型的方法示意图如图1，具体步骤如下：

(1)确定miR-32-5p基因的特异性靶位点sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3；所述miR-32-5p的sgRNA1靶序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA2靶序列如SEQ ID NO.2所示，sgRNA3靶序列如SEQ ID NO.3所示；

其中，SEQ ID NO.1：TACTAAGTTGCATGTTGTCACGG

SEQ ID NO.2：CCTCAATGCAATTTAGTGTGTGT

SEQ ID NO.3：GTTCCCTCTGCTTGCTCTGGTGG；

(2)将C57/BL6雌性小鼠促排卵和体外受精；

(3)将步骤(1)所述的sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3与Cas9核酸酶mRNA体外转录后，显微注射到受精卵中，将受精卵移植到代孕母鼠子宫，繁育得到F0代小鼠，对其进行剪尾，提取DNA进行测序；

(4)将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配繁育得到F1代杂合子小鼠；野生型小鼠基因组序列如SEQ ID NO.4，测序结果如图2；杂合子小鼠基因组序列如SEQ ID NO.5，测序结果如图3；

其中，SEQ ID NO.4：