[发明专利]一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法

权利要求书

1.一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：白念珠菌活化

将白念珠菌接种于SDB培养基中，摇床孵育20～28h；培养液离心后收集真菌细胞，用无菌PBS缓冲液清洗，然后将清洗所得真菌细胞重悬于RPMI-1640培养基中，再孵育12-18h，然后在4℃条件下，以2500～3500转/min离心，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基调整真菌细胞浓度到0.8～1.2×10⁶CFU/ml，得到重悬菌液；

第二步：流动态白念珠菌生物被膜孵育

将医用导管片在乙醇中浸泡以保持无菌，用无菌水清洗后，再将其加入到所述重悬菌液中，在摇床中孵育，使白念珠菌粘附于所述医用导管片上，然后对粘附在医用导管片上的白念珠菌进行流动孵育，结束后孵育得到形成有成熟生物被膜的白念珠菌；

第三步：将形成有成熟生物被膜的白念珠菌加入pH值为7.8的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄离子缓冲液中，先涡旋震荡，然后再超声处理得到悬浮液，将强酸性阳离子交换树脂与悬浮液混合，摇床孵育2～4h，接着用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，以7500～8500rpm/min离心2～4min，得到上清液。

2.根据权利要求1所述的白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：每升SDB培养基含有10g蛋白胨，20g琼脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。

3.根据权利要求1所述的白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：所述RPMI-1640培养基的原料配方包含下列质量百分比的原料：1％的甘露醇、1％的营养肉汤、0.2％的K₂HPO₄和1.35％的琼脂粉。

4.根据权利要求1所述的白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：每升所述真菌培养基含有400mg的氯化钾、6000mg的氯化钠、2000mg的葡萄糖、290.00mg的L-精氨酸、50mg的L-天冬酰胺、20mg的L-天冬氨酸、65.15mg的L-胱氨酸二盐酸盐、20mg的L-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的L-组氨酸、20mg的L-羟脯氨酸、50mg的L-异亮氨酸、50mg的L-亮氨酸、40mg的L-赖氨酸、15mg的L-甲硫氨酸、15mg的L-苯丙氨酸、20mg的L-脯氨酸、30mg的L-丝氨酸、20mg的L-苏氨酸、5mg的L-色氨酸、23.19mg的L-酪氨酸、20mg的L-缬氨酸，100ml的质量浓度为10％的胎牛血清，其余为纯化水，然后用3-(N-玛琳代)丙磺酸调整pH值至7.0。

5.根据权利要求1所述的白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：所述上清液保存在-80℃低温冰箱，在检测之前，冰上解冻后移取100μL样本至EP管中，加入300μL甲醇，再加入10μL内标L-2-氯苯丙氨酸，涡旋混匀后，在冰水浴中进行超声处理超声；结束后在-20℃条件下静置0.5～1.5h；接着在4℃条件下，以10000～14000rpm速度离心10～20min；最后取出200μL的上清置于进样瓶中进行上机检测。

6.根据权利要求5所述的白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于：超声处理的时间为10min，超声波频率为25-35KHz，功率密度为0.35-0.45w/cm²。