[发明专利]用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法、检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于靶向病原体基因RNA的gRNA，本发明还提供了一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)‑C2c2系统的人病原体基因检测方法、检测试剂盒。本发明提供了检测方法，综合了gRNA靶向识别病原体基因转录产物RNA(靶标RNA序列)的优势以及当CRISPR‑C2c2复合物检测到靶标RNA序列时，复合物会切割带有检测标记的报告RNA，释放可检测信号的特点，将CRISPR‑C2c2系统应用在病原体基因检测中，灵敏度高、准确度高，是一种具有巨大商业应用价值的检测方法及检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因检测及基因修饰领域，涉及一种用于特异性靶向病原体基因RNA的gRNA，及一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统的病原体基因检测方法、检测试剂盒；特别涉及一种用于特异性靶向病原体抗性基因和/或特异基因RNA的gRNA，及一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统的病原体抗性基因和/或特异基因检测方法、检测试剂盒。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的获得性免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA或RNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。

CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1等)来发挥功能。其中，Cas9,Cpf1,C2c1均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前，Cas9和Cpf1蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在且巨大的临床应用价值。

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR-Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接 (Non-homologous end joining,NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。CRISPR/Cas9 是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。